栀子苷在大鼠体内的药代动力学研究*

王又红,郭琳琳,刘卫红,李 强

(1.河南中医学院第一附属医院,河南郑州 450000;2.河南中医学院,河南郑州 450008)

栀子又名山栀子、黄栀子,为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实,具有利胆、镇痛、降压和抑菌抗炎等作用[1]。临床常用中药中许多方剂中含有栀子,栀子苷是栀子中具有显著生理活性的成分。本实验采用高效液相色谱(HPLC)法测定注射栀子苷后栀子苷在大鼠体内的血药浓度,研究注射栀子苷后栀子苷在体内的药代动力学特征,以期为栀子及其有效成分的合理使用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级SD大鼠,雄性,体质量220 g左右,由河南医科大学动物中心提供,动物质量许可证号: SCXK(豫)2010-0002。

1.2 药品与试剂

栀子苷对照品,购于中国药品检验所,批号110749-200613;90%栀子苷,购于四川双子叶生物科技有限公司,批号SZY081216;甲醇为色谱醇,迪马公司产品;水为自制纯净水,其余试剂均为分析纯。

1.3 仪 器

Sartorious CP 225D型电子天平,产地德国;美国Waters 2695型高效液相色谱仪(包括自动进样系统、四元泵、在线真空脱气、Waters 2996PDA-二极管阵列检测器);QL-901旋涡混合器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品;BF-2000氮气吹干仪,北京八方世纪科技有限公司产品;SZ-93自动双重纯水蒸馏器,上海亚荣生化仪器厂产品。

1.4 色谱条件[2]

Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为甲醇∶水(30∶70);体积流量为1.0mL/min;检测波长为238 nm;柱温为30℃,进样量为10μL。

1.5 对照品溶液的制备

精密称取栀子苷对照品 10 mg,用甲醇溶解于10mL容量瓶中,定容至刻度,即得浓度为1 g/L的栀子苷对照品母液,将母液稀释配制成系列质量浓度的栀子苷对照品溶液。

1.6 动物实验方法

对SD大鼠进行颈静脉插管手术,将术后恢复正常的健康大鼠用于栀子苷的药代动力学实验。给药前将插管大鼠禁食不禁水 12 h,每只大鼠按12.5μg/g的剂量尾静脉注射给予栀子苷,分别于给药后 1,5,10,20,30,40,60,90,120,180 min经颈静脉插管取血0.5m L于肝素化离心管中,6 000 r/min离心15 min,分离出血浆,-20℃保存备用。

1.7 血浆样品预处理[2-5]

吸取 200μL血浆置离心管中,加甲醇∶乙腈(3∶1)的混合溶剂 800μL沉淀蛋白,涡旋混匀1m in,6 000 r/min离心15min,吸取上清液,氮气气流下吹干,残渣加入流动相 100μL溶解,超声5m in,15 000 r/min离心15 min,吸取上清液,进样检测分析。

2 结 果

2.1 专属性试验

在上述的色谱条件下,测得栀子苷对照品溶液、大鼠空白血浆、大鼠空白血浆加栀子苷对照品溶液及注射栀子苷后血浆样品色谱图(见图1)。由图可知栀子苷的峰形良好,保留时间约为5.2 min,分离度大于 1.5,空白血浆样品中的内源性物质不干扰栀子苷血药浓度的分析。

图1 栀子苷对照品溶液、大鼠空白血浆、大鼠空白血浆加栀子苷对照品溶液及注射栀子苷后血浆样品色谱图

2.2 线性关系考察

取大鼠空白血浆200μL,分别加入不同浓度的栀子苷对照品溶液100μL,配制成浓度为0.1,0.2, 0.4,1.0,2.0,4.0,10.0,20.0,40.0,100.0, 200.0 mg/L的标准血浆样品,除不加 100μL甲醇外,其他按照 1.7项下的方法操作处理样品,按1.4项中所述色谱条件下进样测定,记录栀子苷的峰面积,并以栀子苷的峰面积(A)对栀子苷质量浓度(C)进行线性回归,所得栀子苷标准曲线回归方程: A=46 573C+2 011.7(R2=0.999 6,0.1～4 mg/L)和A=43 426C+65 321(R2=0.999 2,4～200 mg/L),血浆药物浓度在0.1～200mg/L范围内线性关系良好,定量下线为0.1 mg/L。

2.3 回收率试验

取空白血浆 200μL,分别制备低、中、高 3个浓度(0.2,4,100mg/L)的标准血浆样品,按1.7项下方法处理,按 1.4项中所述色谱条件下进样测定,平行操作 5次,以标准曲线求算实测浓度,与理论浓度进行比较,计算回收率。其低、中、高 3个浓度的回收率分别为96.37±4.05,98.82±3.08,100.49± 2.64,相对标准偏差RSD值分别为4.20%、3.12%、2.63%(n=5)。

2.4 精密度试验

分别配制低、中、高 3个质量浓度(0.2,4.0, 100.0mg/L)的标准血浆样品,按1.7项下方法处理,按 1.4项中所述色谱条件下进样测定,每个浓度的样品制备 5份,当天将样品进行检测,以评价日内精密度。同法连续5 d内,每天测定低、中、高 3个浓度的样品,每个浓度 5份,以评价日间精密度。结果表明:日内精密度的 RSD值分别为5.15%、2.93%、2.37%,日间精密度的 RSD值分别为5.76%、3.16%、2.67%(n=5)。

2.5 稳定性试验

分别取低、中、高 3个质量浓度(0.2,4.0, 100.0 mg/L)的血浆样品,每个浓度5份,将样品按1.7项下方法处理,于制备后 0,2,4,8,12 h按 1.4项中所述色谱条件下进样测定,计算RSD值,3个浓度的RSD值分别为3.60%、2.04%、2.43%。结果表明标准血浆样品室温放置 12 h稳定性良好。同法配制低、中、高 3个质量浓度的标准血浆样品,保存于 -20℃冰箱中,分别于 0,1,2,3,4 d取出,于室温下融化,按所建的方法操作测定,计算RSD值、3个浓度的RSD值分别为4.19%、2.72%、2.52%。结果表明标准血浆样品的冻存稳定性良好。

2.6 药代动力学参数

运用3P87药代动力学程序计算栀子苷的药代动力学参数,按房室模型进行模拟,结合AIC值最小和相关系数 r值最大原则,结果表明,注射栀子苷后栀子苷在大鼠体内的过程符合三室模型。其药时曲线见图 2,主要药代动力学参数见表 1。

图2 栀子苷在大鼠体内的血药浓度-时间曲线

表1 栀子苷在大鼠体内的药代动力学参数

3 讨 论

本实验在选择液相色谱方法时,参考相关文献[2-3,5-7],曾采用不同比例的甲醇 -水,乙腈 -水作流动相,实验表明在甲醇∶水 -30∶70的流动相条件下,栀子苷峰形态良好,保留时间适中;血浆样品处理过程中,由于栀子苷为环烯醚萜苷,极性较大,在乙酸乙酯中溶解性较小,因而提取回收率比较低,达不到实验的要求,故选用有机溶剂沉淀蛋白的方法[3],尝试用甲醇或乙腈沉淀蛋白。实验发现用甲醇时沉淀杂质不完全,而用乙腈沉淀蛋白时实验的回收率不高,参考文献[4]选用甲醇、乙腈的混合溶剂作沉淀剂,实验效果较好。本实验建立的测定大鼠血浆中栀子苷含量的高效液相色谱法准确可靠,适合生物样品的测定要求。通过实验结果可知大鼠注射栀子苷后的体内药动学过程符合三室模型, T1/2β为 38.614 min左右,说明栀子苷消除快,在体内滞留时间短;T1/2β大于T1/2α说明栀子苷在大鼠体内主要以消除过程为主。本实验明确了注射栀子苷后栀子苷在体内的药代动力学特征,并获得了相关的药代动力学参数,以期为栀子及其有效成分的合理应用提供参考。

[1]阴健.中药现代研究与临床应用[M].北京:学苑出版社,1993:417.

[2]丁光超,王芳芳,叶肖栗.黄连解毒胶囊中栀子苷在大鼠体内药代动力学研究[J].西北药学杂志,2009,24(1): 50-51.

[3]肖学凤,乔晓莉,高岚,等.黄连解毒汤中栀子苷在大鼠体内的药动学研究[J].天津中医药,2008,25(4):328-329.

[4]高荣.银黄注射液和银黄口服液在大鼠体内的药动学 -药效学研究和代谢组学初步研究[D].成都:四川大学, 2007.

[5]杨明,陈晓燕,张海燕,等.栀子苷 4种不同给药途径的药动学研究[J].中国新药杂志,2010,19(9):746-749.

[6]张丽茹.栀子及其复方制剂中京尼平苷的药物动力学行为比较研究[D].沈阳:沈阳药科大学,2004.

[7]卢兴红,张兰桐,袁志芳,等.RP-HPLC法测定血浆中栀子苷浓度及药动学研究[J].药物分析杂志,2004,24 (2):140-143.