用改良Hodge 试验检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌

杨 燕，孙长贵，陈 坚，熊 敏，成 军

碳青霉烯类抗生素为广谱β-内酰胺类抗生素，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均具有很强的抗菌活性，属于繁殖期杀菌剂，对多种β-内酰胺酶高度稳定，在临床上大部分被用于多重耐药菌株引起的严重感染，尤其用于产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和(或)去阻遏表达β-内酰胺酶(AmpC)的革兰阴性杆菌引起的感染的治疗［1］。近年来，碳青酶烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌所致感染爆发的报道呈现上升趋势［2-3］，给抗感染治疗带来重大挑战［4］。碳青酶烯类抗生素的耐药机制之一是与菌株产生碳青霉烯酶有关，碳青霉烯酶不仅能水解碳青霉烯类抗生素，对其他β-内酰胺类抗生素也具有水解作用。产生该类酶的菌株药敏试验理论上应表现对碳青霉烯药物耐药，但事实上，有部分产酶菌株可表现敏感，此种情况尤其在自动化检测体系中易被忽视，从而导致治疗失败。为了解临床分离的肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶情况，我们用改良的Hodge 试验对碳青霉烯类抗生素敏感折点附近的肠杆菌科细菌进行碳青霉烯酶检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株 390 株肠杆菌科细菌为我院2005 年6月至2008 年6 月从临床送检标本中分离所得。其中大肠埃希菌237 株、克雷伯菌51 株、肠杆菌27株、变形杆菌48 株、枸橼酸杆菌3 株、沙雷菌24 株;无重复分离菌株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 和产TEM-5 型肺炎克雷伯菌。

1.2 试剂 MH 琼脂为杭州天和微生物试剂公司产品。美罗培南、厄他培南、氨曲南、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、阿米卡星、妥布霉素和环丙沙星纸片为Oxoid 公司产品。GNI 细菌鉴定卡为生物梅里埃公司产品。

1.3 仪器设备 Vitek 32 全自动微生物鉴定仪为生物梅里埃公司产品，PHW-165Q 型恒温培养箱为宁波自动化仪表研究所产品。

1.4 药物敏感性试验及待测菌株的筛选 使用标准的K-B 纸片琼脂扩散法检测肠杆菌科细菌对两种碳青霉烯类抗生素的耐药性。按照CLSI(美国临床和实验室标准化协会)M100-S19 文件推荐，筛选厄他培南抑菌圈直径在19 ～21 mm 或美罗培南抑菌圈直径在16 ～21 mm 的肠杆菌科细菌，进行改良Hodge 试验。

1.5 改良的Hodge 试验(MHT)［5］将10 倍稀释的0.5 麦氏浊度大肠埃希菌ATCC 25922 悬液均匀涂布于MH 琼脂平板，使平板干燥3 ～10 min，于平板中央贴一片厄他培南或美罗培南纸片。用10 μl接种环或拭子，挑取血琼脂平板过夜生长的3 ～5 个待测菌菌落或质量控制菌株悬液，从纸片边缘到平板边缘的方向划直线接种。划线至少有20 ～25 mm长。35℃培养16 ～20 h。若待测菌产生碳青霉烯酶，其接种线与大肠埃希菌ATCC 25922 抑菌环交界处会产生朝向抑菌圈内增强生长现象，即MHT 阳性;反之则为阴性。见图1。

图1 改良Hodge 试验结果

1.6 ESBLs 检测 采用CLSI M100-S19 文件推荐方法［5］。

1.7 质量控制 用大肠埃希菌ATCC 25922 进行常规纸片扩散法药敏试验质量控制，两种碳青霉烯类抗生素对质控菌株的抑菌环结果均在CLSI 的允许范围内。改良的Hodge 试验质量控制，用MHT 阳性菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 和MHT 阴性菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 进行。

2 结 果

2.1 药敏试验筛选结果 K-B 纸片琼脂扩散法检测390 株肠杆菌科细菌，筛选得到厄他培南抑菌环直径在19 ～21 mm 或美罗培南抑菌环直径在16 ～21 mm 的肠杆菌科细菌55 株，其中大肠埃希菌22株，克雷伯菌12 株，肠杆菌10 株，变形杆菌9 株，沙雷菌2 株。

2.2 改良Hodge 试验结果 55 株待测菌株，MHT阳性12 株，其中大肠埃希菌9 株，阴沟肠杆菌2 株，肺炎克雷伯菌1 株。MHT 阳性菌株的碳青霉烯类抗生素抑菌圈直径结果见表1。

表1 MHT 阳性菌株碳青霉烯类抗生素抑菌圈直径(mm)

2.3 MHT 阳性菌株药敏试验结果及产生ESBL 情况 12 株MHT 阳性菌株均产ESBL;对部分抗生素敏感试验结果见表2。

3 讨 论

碳青霉烯酶是具有强大水解能力的β-内酰胺酶，能水解青霉素、头孢菌素、单环内酰胺类及碳青霉烯类抗生素。碳青霉烯酶属于Ambler 分子分类法的A 类、B 类和D 类β-内酰胺酶。A 类和D 类酶的活性部位具有丝氨酸;B 类酶即金属β-内酰胺酶，其活性部位具有锌离子。A 类酶包括阴沟肠杆菌的IMI 21 和NMC 2A 酶、粘质沙雷菌中由染色体介导的NMC 2A、Sme 21、Sme 22、Sme 23、IMI 21 酶，以及肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中质粒介导的KPC 1、GES 22 酶。其中以肺炎克雷伯菌KPC 酶传播最广，多见于肠杆菌科细菌，最早分离于肺炎克雷伯菌，由质粒编码介导。A 类酶可被克拉维酸和他唑巴坦等β-内酰胺抗生素所抑制。D 类酶由OXA型酶组成，多见于鲍曼不动杆菌。金属酶多见于铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和沙雷菌等［2］。

表2 部分抗菌药物对MHT 阳性菌株的抑菌圈直径(mm)

本研究根据CLSI 推荐［5］，选择厄他培南抑菌环在19 ～21mm 或美罗培南抑菌环在16 ～21mm 的肠杆菌科细菌作为待测菌，旨在检出表型试验敏感而非耐药的产酶菌株，以确保药敏试验结果准确，为临床正确用药提供依据。从本研究MHT 阳性结果来看，符合厄他培南筛选条件的MHT 阳性株占总阳性株的83.33%(10/12)，符合美罗培南筛选条件的MHT 阳性株占总阳性株的25%(3/12)。提示厄他培南筛选的指示效果高于美罗培南，临床实验室应尽可能考虑用厄他培南纸片进行筛选试验。

研究结果表明，我院肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶以大肠埃希菌较为多见，占MHT 阳性菌的75%(9/12)，其次为阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌。因此，临床实验室应在进行常规药敏试验时，应加强对这类菌株产碳青霉烯酶的监测。

本次研究中改良Hodge 试验阳性的菌株均产ESBL。由于碳青霉烯类抗生素为治疗产ESBL 肠杆菌科细菌引起的严重感染的一线药物［6］，所以临床实验室对ESBL 阳性菌进行改良Hodge 试验检测其是否产碳青霉烯酶很重要。

对于MHT 阳性而对碳青霉烯类抗生素表型试验敏感的肠杆菌科细菌，CLSI 建议在报告结果前，应执行MIC 试验，如对任一种碳青霉烯类药物敏感(厄他培南MIC≤2 μg/ml、美罗培南MIC≤4 μg/ml或亚胺培南MIC≤4 μg/ml)，只报告碳青霉烯类药物的MIC，无需解释结果。报告中可作如下注释，“此菌株被证明产碳青霉烯酶。用碳青霉烯类药物治疗药敏试验对碳青霉烯类药物敏感但体外试验证明产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌引起的感染，其临床疗效尚不明确。”

抗生素是临床治疗感染性疾病的最有力武器［7］，抗生素的滥用导致耐药菌株日趋增多、耐药程度日趋增强，迫使我们需要进一步合理使用抗生素。以亚胺培南和美罗培南为代表的碳青霉烯类抗生素为治疗重度感染的一线经验治疗药物［8］，然而碳青霉烯类抗生素药敏试验敏感但产碳青霉烯酶的菌株引起的临床感染，给临床治疗带来较大的困扰。临床微生物学实验室应建立测试碳青霉烯酶方法，及时准确的报告结果。

改良的Hodge 试验，可用于检测碳青酶烯类抗生素敏感的菌株产碳青酶烯酶的情况，在检测肠杆菌科细菌时具有90%以上的敏感性和特异性［5］，但此法为一种表型试验，不能将碳青霉烯酶分型。对于MHT 试验阳性菌株的基因分型，还有赖于PCR进行基因检测。

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