LASIK术后早期角膜上皮厚度变化的相关因素及其相互关系

乔丽萍 孙惠敏 赵少贞 杨 柳 袁佳琴

有学者认为,准分子激光原位角膜磨镶术(laser assisted in-situ keratomileusis,LASIK)后角膜上皮发生改变的现象可能与屈光回退有一定关系[1]。共聚焦显微镜(confocalm icroscopy,CM)是一种高清晰度、高放大倍率的活体显微镜检查技术。它可以在活体状态下,无创伤、实时地从细胞水平观察LASIK术后不同时间点角膜各层组织的动态变化,直接获得活体角膜上皮、基质及角膜厚度等信息,为研究提供客观、定量的测量分析数据。本研究应用 CM对LASIK术后48例(48眼)患者的角膜上皮厚度进行观察,旨在评价角膜上皮厚度变化与组织学改变之间的关系,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择 2003年11月至 2006年 1月于武警医学院附属医院和天津医科大学眼科中心进行LASIK术的患者48例(48眼),其中男22例,女26例,均为右眼;年龄 18～30岁,平均(24.45± 0.86)岁。术前等效球镜值为2.25～-12.50 D,平均(-5.61±2.75)D。按等效球镜值不同将所有患者分为低中度近视组(≤-6.00 D;21眼)与高度近视组(＞-6.00D;27眼)[2]。纳入条件:(1)无软性或硬性角膜接触镜配戴史;(2)未发现与LASIK术相关的并发症;(3)无眼外伤史、无眼内疾病,如青光眼等;(4)无服用过影响角膜代谢的药物,如乙胺碘呋酮、异维甲酸等;(5)无全身性疾患,如糖尿病、甲状腺疾病、活动性胶原血管疾病等;2组患者年龄差异无显著统计学意义(t=-1.032,P=0.220)。

1.2 检测方法 所有患者均于术前进行裸眼视力检查、散瞳检影、电脑验光(auto REF-keratometer, ARK-700,SEED)、眼前节检查、角膜地形图测量角膜曲率(EyemapEH-290,Alcon)、直接或间接检眼镜检查眼底以及CM(Confoscan 3.0,日本NIDEK公司)检查角膜上皮厚度。主要装置:12V/100W的卤素光源和IR(红外线)、UP(紫外线)滤过器、40× 0.75W∞/0水浸式物镜、CCD照相机、高速数码录图像机、PC计算机、LCDS-VGA15显示器、NAVIS软件系统。放大倍数为 1 000;水浸式物镜的视野为330mm×400 mm;景深 10μm,侧像分辨率 1～2μm,物镜与角膜的距离为 2 mm;扫描频率为20 Hz,每次扫描 350幅图。完成一次扫描需 7 s。每幅图像大约可见475 mm×350 mm角膜组织,扫描厚度为8μm,背景相对暗度为10DB,并确保物镜有恒定的扫描速度。本研究采用半自动扫描。

所有患者分别于术后第 1天、第 3天、第 7天、第 10天、第30天、第 60天、第 90天行最佳远视力检查、电脑验光、角膜地形图测量角膜曲率及CM检查角膜厚度。

1.3 手术方法 采用VISX Laser(VISX,Santa,CA)第三代产品,波长193 nm,固定脉冲频率为6～8Hz,能量为160 mJ·cm-2。使用自动角膜刀(Moria, M 2)制作预计厚度150μm,直径为8.5～9.0 mm的角膜瓣。手术步骤:(1)冲洗手术眼,消毒手术区,表面麻醉,铺洞巾;(2)制作预计150μm厚度的角膜瓣;(3)选用6.0mm范围激光切削;(4)冲洗基质床(林格液);(5)复位角膜瓣。所有手术均由同一医师完成。术眼均不包扎。术后 4 h开始滴用妥布霉素滴眼液,每天 4次,共 3 d。每 2天复诊后,双眼给予 1 g·L-1氟米龙滴眼液滴眼。第 1周每天 4次,第 2周每天 3次,第3周每天 2次,第 4周每天1次,至停止用药。

1.4 数据采集 CM的Z-scan曲线可以通过光强度值的变化来反映角膜新陈代谢状况。术后角膜 Z-scan曲线中可以辨认上皮波、Bowman层神经纤维丛波、界面波、激活细胞区域波型、内皮波。选择眼球无侧向运动和前后运动,波形完整的Z-scan曲线用于测量,获取数据。

图 1中a为表皮波,b为基底细胞层波,c为神经纤维丛波,d为最前部基质细胞波,e为界面(异常颗粒),f为界面下激活细胞波,g为基质细胞波,h为内皮波。f波波长为激活细胞的深度。角膜厚度为内皮波峰与表皮波峰之间的距离;上皮厚度为表皮波峰与Bowman层神经纤维波峰之间的距离;术后因神经纤维丛在制作角膜瓣时被切断,随后被激光切削,不能显影,但在Z-scan曲线上相应区域仍有波型,术后上皮厚度应是表皮波峰与相应神经丛波峰之间的距离;LASIK术后角膜组织反应使得部分角膜基质细胞在Z-scan曲线的光强度值有所改变,细胞反光增强,被认为有“激活”。在扫描曲线出现了相应的高波,波长即是基质激活区域的深度。以上所采集数据,均以测量 3次取平均值作为统计数据。

Figure 1 Z-scan curve Z-scan曲线

1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视力 术后第 1天、第3天、第7天、第 10天、第 30天、第 60天、第 90天视力分别为1.34±0.66、1.24±0.76、1.27±0.73、1.26±0.76、1.08±0.80、0.96±0.76、0.80±0.72。术后第90天,低度、中度近视组与高度近视组视力差异无统计学意义(均为P＜0.05)。

2.2 屈光状态变化 LASIK术后第1天、第3天、第 7天、第 10天、第 30天、第 60天、第 90天屈光状态平均偏移分别为(1.07±0.63)D、(0.97±0.63) D、(0.79±0.63)D、(0.74±0.64)D、(0.37±0.34) D、(0.50±0.33)D、(0.47±0.52)D,屈光状态逐渐由远视状态向正视或近视漂移,这种变化在高度近视眼体现更为明显。

2.3 角膜上皮厚度变化 与术前相比,48例(48眼)LASIK术后角膜上皮厚度平均增加10.7%。角膜上皮厚度从术后第 1天开始增长,第 7-10天最为明显。术后第 90天,平均角膜上皮厚度高于术前(49.16±8.92)μm。低中度近视组与高度近视组患眼在术后各时间点角膜上皮厚度比较差异均无显著统计学意义(均为P＞0.05,见表1),但高度近视组患眼上皮厚度增长幅度较大(14.00%)。

CM下,LASIK术后角膜上皮细胞形态发生变化,厚度增加。术后第 1天,角膜上皮形态改变,出现多角形表层上皮,光反射度高于正常细胞(图 2)。术后第3天,上皮出现“层化”现象(图 3),细胞核消失,细胞变大,排列紊乱,反光强度增强,基底膜水肿,基底细胞边界明显隆起,形成嵴状(图 4)。术后第10天,上皮细胞反射异常增高,但排列较为整齐(图5)。术后第 30天,上皮细胞排列整齐,光反射正常,但下方稀疏,细胞部分缺失上皮(图 6)。术后第60天、第 90天上皮细胞形态接近正常(图7)。

2.4 角膜上皮厚度变化的相关性 CM下,LASIK术后基质形态学发生改变。术后第 1天,手术界面以下基质中角膜细胞高反射,呈卵圆形,与正常角膜细胞的多角形明显有异,称之为“激活细胞”(图8)。术后第 3天,激活细胞变为梭形,并产生高反射的细胞外基质(图9)。高度近视组患者的基质激活细胞平均深度为(65.51±11.48)μm,低中度近视组为(47.72±13.55)μm,2组之间差异有显著统计学意义(t=-4.499,P=0.000)。

表 1 低中度近视组、高度近视组患眼术后不同时间角膜上皮角膜厚度的变化Tab le 1 Changes of thickness of corneal epithelium in low-m edium m yopia group and high m yopia group at different time points (l/μm)

Figure 2 One day after surgery,epithelial cell changed and immature polygonal surface epithelial appeared.Figu re 3 Three days after surgery,the epithelial cells showed high reflection and abnormalmorphology.Figure 4 Three days after surgery,the basementmembrane arised odema,and cell bordersshowed obviousapophysis,forming ridge.Figure 5 Ten daysafter surgery,the reflection ofepithelialcells abonormally increased,but epithelial cellsarranged neatly.Figu re 6 Thirty daysafter surgery,epithelial cellsarranged in order,reflectivity wasnormal,but the normal cells partly loss. Figure 7 Sixty and ninty days after surgery,corneal epithelium showed normal 图2 术后第1天,角膜上皮形态改变,出现多角形的不成熟表层上皮。图 3 术后第3天,角膜上皮细胞高反射,细胞形态异常。图 4 术后第 3天,基底膜水肿,细胞边界明显隆起,成嵴状。图 5 术后第 10天,角膜上皮细胞反射异常增高,但排列较为整齐。图6 术后第 30天,角膜上皮细胞排列整齐,光反射正常,但下方稀疏,细胞部分缺失。图 7 术后第60天、第 90天,角膜上皮形态接近正常

Figure 8 One day after surgery,the oval,larger heratocyte with a higher reflectivitywere known as“activated-cell”.Figure 9 Three daysafter surgery,stroma cell below the“interface”became spindle and produced slightly higher reflective extracellularmatrix 图8 术后第1天,基质中角膜细胞高反射,呈卵圆形,称之为“激活细胞”。图 9 术后第 3天,“界面”以下基质中角膜细胞变长为梭形,并产生反射稍高的细胞外基质

LASIK术后,平均角膜上皮厚度变化与术前等效球镜值、角膜前表面曲率变化呈正相关 (r1= 0.538,P1=0.047;r2=0.648,P2=0.007)。角膜上皮厚度变化与基质厚度、角膜瓣厚度、基质细胞激活深度无相关性(r1=0.238,P1=0.647;r2=0.197, P2=0.841;r3=0.214,P3=0.714)。

3 讨论

角膜创伤修复是一个复杂的过程,通常包括角膜细胞的激活、增殖、分化及细胞因子的释放、细胞外基质的合成与重构等,是众多细胞因子和多种细胞在时间和空间上高度协调而完成的。创伤修复反应的差异性已成为影响各种屈光性角膜手术稳定性和预测性的重要因素[3]。近年来,人们通过兔、鼠等大量动物实验来探求LASIK术后的创伤修复过程,但兔眼角膜缺乏前弹力层,与人眼角膜结构存在明显种属差异,其结果不能完全替代人眼角膜的愈合状态。CM的应用为活体客观研究屈光手术后的角膜变化提供了良好的工具。

弥补性上皮增殖被认为是准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)后屈光回退的机制[4]。有报道表明:PRK术后近视漂移与上皮增殖有一定的关系,且上皮厚度每增长 18μm,会产生1.00 D的近视[5]。Esquenazi等[6]和Gauthier等[7]报道猴与人在PRK术后角膜上皮有过度增殖的现象。Assil等[8]在角膜放置基质环眼和其他屈光手术眼中亦发现相同的上皮增殖现象。传统认为,上皮细胞增殖一般多见于基质损伤的角膜病患眼,为了保持角膜表面的光滑,上皮细胞通过增殖来充填基质缺损,恢复角膜表面原有的曲率。本研究对LASIK术后角膜中央上皮的测量证实了上皮在角膜受到创伤后发生增殖的现象。CM下观察到术后角膜上皮形态发生改变,厚度增加,表现为细胞轮廓变大,排列紊乱,反光强度增高。基底膜细胞边界较术前隆起,边缘锐利,反光增强。这种变化在深度切削眼中尤为明显。CM下角膜上皮在角膜受到创伤后出现“层化”和增厚现象,证实了上皮在角膜切削后的变化。我国学者对术后各时间点角膜全厚、角膜基质厚度、角膜瓣基质厚度、基质床厚度的研究表明,角膜各层厚度的增长其差异性没有统计学意义[9],所以不足以用基质增厚来解释组织修复。本研究结果表明,术后早期角膜上皮参与了LASIK术后早期角膜组织修复的过程,上皮厚度增加。随着术后角膜修复时间的延长,上皮细胞排列趋于整齐,形态接近正常,反射强度由高逐渐降低。随之,角膜趋于安静状态,屈光状态趋于稳定。这一观点对术后早期用药有一定的指导意义。

在角膜基质界面上、下出现了大量的“激活细胞”,其细胞核伸长为梭形,不规则排列,具有细胞核多突起、反光强度高等特点,被认为是基质细胞受刺激后转化为成纤维细胞,分泌细胞外基质以修复创伤。本研究进一步观察到高度近视眼的基质激活细胞深度与低中度近视眼之间存在明显差异。换言之,激光切削基质量越大,基质激活细胞的数量就越多[10]。Taliana等[11]认为当上皮和基质受到创伤时,上皮细胞和角膜基质细胞均直接参与修复过程,基质细胞转化为纤维母细胞,而基质细胞与纤维母细胞比值的大小直接影响到上皮的改变,上皮的这种改变不同于上皮细胞正常新陈代谢时的分化,它可以促使上皮细胞排列,更符合角膜的生理要求。LASIK术后的上皮重塑原因不明。Reinstein等[12]推测,LASIK术后角膜上皮厚度的变化是由于角膜上皮具有弥补其下方基质不正常而导致角膜曲率改变的能力,是一种自我修饰和自我修复的表现。上皮厚度的变化与角膜表面的形态改变关系更加紧密。

LASIK术中角膜瓣过薄或过厚都会对LASIK手术产生一定的影响。本结果表明,角膜上皮的变化与角膜瓣的厚度没有相关性,这一观点已得到众多理论证实。Wachtlin等[13]发现LASIK术后除角膜瓣边缘可见细胞纤连蛋白和tenascin反应呈阳性外,层间呈无细胞区,愈合反应轻。Maguen等[14]利用免疫组织化学的方法发现LASIK术后层间金属蛋白酶-1、金属蛋白酶-2水平升高,上皮基底膜内的Ⅳ型胶原异构体减少。这些研究都反映了LASIK术后角膜层间愈合反应轻,角膜瓣与瓣下基质床之间不能形成瘢痕组织,二者贴合不够紧密。这种特殊的愈合方式虽然保留了清晰的视觉光区,但在功能上存在异常,抵抗外力弱,对维持角膜的机械抵抗力无直接作用,这些研究结果证实了角膜瓣的薄厚没有引发角膜上皮的重塑[15]。

综上所述,术后早期角膜上皮厚度增加,上皮参与了LASIK术后早期角膜组织修复的过程,LASIK术后屈光状态变化与上皮厚度的增减有关。适度抑制LASIK术后角膜上皮细胞的增殖,从而控制角膜上皮的过度增生,这一结果可能对术后屈光状态回退明显的高度近视患者具有重要的临床意义。

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