猪蓝耳病与圆环病毒混合感染的诊断

陈元坤，欧红萍，刘宗秀，李犹平

（1.四川省新兽药工程技术研究中心，四川 成都 611130；2.成都农业科技职业学院，四川 成都 611130）

1 流行病学

2011年3月，遂宁某猪场从外地引进100多头仔猪2周后，引进猪和猪场原有母猪、仔猪同时发病，母猪发病率30%，死亡率10%左右，仔猪发病率90%，死亡率85%以上。猪场猪瘟的免疫已按正规免疫程序进行，母猪在1年前免疫过经典蓝耳疫苗，3个月前曾采取血液进行ELISA抗体测定，发现经典蓝耳血清抗体水平异常偏高，未对高致病性蓝耳病进行免疫。

2 临诊症状

母猪体温升高，在39.6～40.5℃，流产、产死胎，有的死亡；仔猪体温升高至40.2～41℃，呼吸急促，耳根、臀、尾、腹部皮肤呈紫红色，发病后大量死亡。

3 剖解病变

死亡猪只剖解的主要病变在肺脏，肺严重出血、坏死、肉变、间质增宽、呈暗红色；肺门淋巴结、肠系膜淋巴结及腹股沟淋巴结肿大、出血；胃黏膜充血，有的溃疡；肾脏出血并有明显坏死灶；脾脏有少量出血。

4 实验室PCR病原检测

4.1 试验材料 猪经典蓝耳病毒、高致病性蓝耳病毒与圆环病毒阳性对照。猪经典蓝耳病毒阳性对照采用猪蓝耳病弱毒活疫苗CH-1R株，高致病性蓝耳病采用弱毒活疫苗TJM-F92株，均由遂宁市船山区畜牧局提供；圆环病毒阳性对照为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产。

待检测病料：为送检的剖解病变典型的肺脏、淋巴结、肾、脾脏等冷冻2d的病料，送检病料为2头份。

引物：猪经典蓝耳病病毒基因序列参照李勇等设计合成的位于美洲型毒株ORF7，即N蛋白基因区内，上游引物PRRS-F：5′-TAAATATGCCAAAAACAAC-3′，下游引物PRRS-R：5′-TAGGTGACTTAGAGGCACA-3′，扩增片段长度为468bp。高致病性蓝耳病毒基因引物参照范仲鑫等公开发表的引物序列，上游引物HPRRS-F：CGTAGAACTGTGACAACAAC，跨缺失区，对应于变异株序列的2917-2936，下游引物HPRRSR：TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT，对应于变异株序列的3142-3162，目标产物长度为246bp。猪圆环病毒Ⅱ型基因引物参照许秀梅等设计合成的序列，上游引物PCVⅡ-F：5′-TAGGTTAGGGC（A/T）（G/T）TGGCCTT-3′，下游引物PCVⅡ-R：5′-CCGCACCTTCGGATATAGTGT-3′，扩增产物长度为263bp。

分子生物学试剂：病毒RNA提取试剂盒，病毒DNA提取试剂盒，2×Taq PCR Mixture反应试剂，标准DNA Marker2000、标准DNA MarkerⅡ等均购自北京天根生物科技有限公司；cDNA第一链合成试剂盒为TOYOTA(日本东洋纺)产品。

4.2 试验方法 取病料适量，剪碎后加适量生理盐水研磨，8000r/min离心1min，取上清用于病毒RNA和DNA的提取，提取方法按试剂盒说明进行。猪蓝耳病、高致病性蓝耳病RNA反转录体系和反转录程序为：病毒RNA 5μL，特异性下游引物1μL，dNTP mixture 2μL，RNase Inhibitor 1μL，Rever TraACE 1μL，5×RT Buffer 4μL，RNase free H2O 6μL，总共20μL；42℃，45min，99℃，5 min。反转录后按以下体系和程序进行PCR扩增：ddH2O 7.5μL，cDNA/DNA 3μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Mixture 12.5 μL；94℃预变性3 min后，95℃ 30 s，蓝耳病56℃、高致病性蓝耳病52℃、圆环病毒Ⅱ62℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳，当阳性对照和被检样品均扩增出与预期大小一致的条带时判定为阳性结果，反之为阴性。

4.3 试验结果 猪经典蓝耳、高致病性蓝耳与圆环病毒Ⅱ型提取病毒基因组在进行PCR扩增后，阳性对照和被检样品均扩增出了与预期大小一致的条带，猪经典蓝耳阳性对照及被检样品为468bp、高致病性蓝耳阳性对照及被检样品为246bp，圆环病毒Ⅱ型阳性对照及被检样品为263bp左右，见图1～图3。结果表明被检样品中猪经典蓝耳、高致病性蓝耳与圆环病毒Ⅱ型为阳性，阳性率100%。

图1 经典蓝耳病毒PCR检测结果

图2 高致病性蓝耳病毒PCR检测结果

图3 圆环病毒Ⅱ型PCR检测结果

5 讨论

蓝耳病主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状，临诊特征与猪瘟及许多呼吸道疾病相似，单独依靠流行病学资料、症状及剖检病变还不能确诊，需要进一步的实验室诊断。我们根据猪群的发病死亡情况、免疫状况、临诊症状及剖解病变特征怀疑为蓝耳病感染，同时由于猪场普遍存在圆环病毒的感染，所以我们对送检病料进行了经典蓝耳、高致病性蓝耳和圆环病毒Ⅱ型的PCR检测，结果3种传染病的阳性检测率为100%。

近年来，猪场传染病混合感染是导致猪只死亡和造成经济损失的主要原因。两年来我们对猪场送检病料的病原检测结果发现，猪场中蓝耳病与圆环病毒的混合感染较普遍，受检样品中阳性率在90%以上，说明猪蓝耳病和圆环病毒病仍是猪群中混合感染的原发性病原。此次送检病料的猪场虽然免疫过经典蓝耳病疫苗，但由于缺乏科学的免疫程序和免疫后的抗体跟踪监测，导致免疫失败而感染野毒，再加上未对高致病性蓝耳病进行免疫，最终同时暴发了经典蓝耳病与高致病性蓝耳病，还混合感染了圆环病毒。因此，在做好猪场生物安全措施的同时，应根据当地疫病流行种类和流行特征、猪只日龄、母源抗体水平情况来制定科学的免疫程序，并根据病情监测结果随时调整免疫程序，采用可靠的免疫方法和抗体监测方法来预防此类传染病的发生。

[1]李 勇，梅书棋，郑 新，等.用RT-PCR对湖北省部分猪场猪繁殖与呼吸综合症的检测[J].华中农业大学学报，2006，19（4）：363-365.

[2]范仲鑫，刘道新，何世成，等.湖南高致病性猪蓝耳病隐性感染情况调查[C].第三届猪病防控学术研讨会会议论文集，153-156.

[3]许秀梅，周绪斌，张馨玉，等.中等规模猪场保育猪圆环病毒病的实验室诊断与控制 [J].中国畜牧兽医，2006，33（12）：72-73.