大蒜素对尼古丁致人牙周膜成纤维细胞氧化毒性的保护作用

李斌龙 谢晓莉 彭解英 罗小良 靳路远

（中南大学湘雅医院 口腔内科，长沙 410008）

大蒜素对尼古丁致人牙周膜成纤维细胞氧化毒性的保护作用

李斌龙 谢晓莉 彭解英 罗小良 靳路远

（中南大学湘雅医院 口腔内科，长沙 410008）

目的 研究大蒜素对尼古丁所致人牙周膜成纤维细胞（HPDLCs）氧化毒性的保护作用。方法 1）建立尼古丁对HPDLCs氧化毒性的模型，采用水溶性四氮唑（WST）比色法选出可有效抑制HPDLCs存活率的尼古丁质量浓度X，用于后续实验。2）将体外培养的第5代HPDLCs分为空白组、尼古丁组、尼古丁+大蒜素组（大蒜素质量浓度分别为15、30、60μg·mL-1），以不同培养液培养24 h后，采用WST比色法选出可显著改善HPDLCs存活率的大蒜素质量浓度Y用于后续实验。3）将体外培养的第5代HPDLCs分为空白组、尼古丁组、尼古丁+大蒜素组，分别于培养1、4、8、12、24 h后测量细胞内谷胱甘肽（GSH）浓度。结果 0.8mg·mL-1尼古丁即可显著抑制HPDLCs存活率（细胞存活率为空白组的77%，P＜0.05，取X为0.8mg·mL-1）；而60μg·mL-1大蒜素可显著改善此负性作用，将细胞存活率提升至尼古丁组的112%（P＜0.05），且与空白组比较无统计学差异（P＞0.05），取Y为60μg·mL-1。在培养后的各时间点，尼古丁+大蒜素组GSH浓度与空白组相比均无统计学差异（P＞0.05），但较尼古丁组均有明显提高（P＜0.05）；培养8 h时，尼古丁+大蒜素组GSH浓度与尼古丁组相比差异最大，前者较后者提高82%。结论 60μg·mL-1大蒜素可以显著降低尼古丁对HPDLCs的氧化损伤作用。

人牙周膜成纤维细胞； 尼古丁； 氧化毒性； 大蒜素； 谷胱甘肽

吸烟是牙周病的重要危险因素。烟草中的尼古丁可以对人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament cells，HPDLCs）产生剂量相关的氧化毒性[1-2]，促进牙周病的发生和发展。大蒜素是从大蒜中提取的天然抗氧化剂，已用于治疗口腔溃疡和难治性根尖周炎等疾病[3]。目前，关于大蒜素是否可抑制尼古丁氧化毒性作用的研究还较少，本实验即对此进行研究，以便为大蒜素用于牙周病的治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

尼古丁（Sigma公司，美国）、大蒜素针剂（山东鲁抗辰欣药业有限公司）、DMEM培养基（Gibco公司，美国）、胎牛血清（江苏碧云天生物技术研究所），96孔及6孔培养板（Corning公司，美国），细胞培养箱，酶标仪，水溶性四氮唑-1（water-soluble tetrazolium，WST-1）试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）、谷胱甘肽（glutathion，GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验方法

1.2.1 HPDLCs的培养和鉴定 取12～18岁正畸患者因治疗需要而拔除的前磨牙，按照司徒镇强组织块培养法[4]进行HPDLCs的原代与传代培养。取状态良好的第5代细胞行免疫组织化学ABC法波形丝蛋白和角蛋白染色，DAB显色进行鉴定。

1.2.2 尼古丁氧化毒性模型的建立 取状态良好的第5代HPDLCs以细胞密度为每毫升5×104个细胞接种于96孔培养板，每孔200μL，培养24 h后弃原培养基。空白组加入DMEM培养基200μL，5个尼古丁组分别加入尼古丁质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1的培养基200μL，另设调零组，每组5复孔。培养20 h后每孔加10μL WST-1液，混匀继续培养4 h后取出，于酶标仪450 nm处读取各组吸光度值A。根据公式：细胞存活率=调零后待测组A值/调零后空白组A值×100%，来计算得出各尼古丁组HPDLCs的存活率。取存活率与空白组有统计学差异的尼古丁组质量浓度用于后续试验（设该质量浓度为X）。

1.2.3 WST比色法检测大蒜素对尼古丁氧化毒性的影响 取状态良好的第5代HPDLCs接种于3块96孔培养板，培养24 h后弃培养基。每板左侧设尼古丁组5孔（3板分别为N1、N2、N3组），每孔加入尼古丁质量浓度为X的培养基200μL；中份设尼古丁+大蒜素组5孔（分别为A1、A2、A3组），每孔加入培养基200μL（尼古丁质量浓度均为X，且A1、A2、A3组大蒜素质量浓度依次为15、30、60μg·mL-1）；右侧设空白组5孔（C1、C2、C3组），加入培养基200μL；每板均另设调零组5孔。培养20 h后每孔加10μL WST-1液，混匀继续培养4 h后取出，读取各组的吸光度值A并计算得出各组HPDLCs存活率。取细胞存活率与同板尼古丁组有统计学差异的尼古丁+大蒜素组的大蒜素质量浓度用于后续试验（设该质量浓度为Y）。

1.2.4 尼古丁和大蒜素共同作用后不同时间点的HPDLCs中GSH浓度的测定 取同步生长的第5代HPDLCs以细胞密度为每毫升6×104个细胞接种于15块6孔板，分尼古丁（N）板、尼古丁+大蒜素（A）板、空白（C）板各5板，每孔2mL，培养24 h后弃培养基。N板每孔加入尼古丁质量浓度为X的培养基2mL，A板每孔加入尼古丁质量浓度为X且大蒜素质量浓度为Y的培养基2mL，C板每孔加入普通培养基2mL。继续培养，分别于1、4、8、12、24 h取出N、A、C板各1块，将每板中上下相对2孔的细胞收集于同一1.5mL离心管内，每管加300μL生理盐水，吹打均匀后加细胞裂解液100μL，混匀后按照GSH试剂盒说明进行后续操作，测定各组GSH的浓度。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件对各实验中每组测定数值的均值进行方差分析，采用LSD检验比较组间的差异，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 HPDLCs的培养和鉴定

细胞培养5～10 d后，有扁平或长梭状细胞从组织块中游出，细胞核较大，呈椭圆形，细胞浆透明，有明显的细胞分叉。电镜下可见细胞内有丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。约20 d后，细胞长满培养皿底的80%。

传代后的细胞形态未发生改变，生长速度加快。经传代2～3次后，细胞逐渐自然纯化。细胞波形丝蛋白染色阳性，细胞浆呈棕黄色着色；角蛋白染色阴性：说明培养的细胞是中胚层来源的成纤维细胞。

2.2 尼古丁对HPDLCs的氧化毒性

尼古丁作用24 h后，各组吸光度值A及细胞存活率见表1。如表1所示：除0.1mg·mL-1组外，各组HPDLCs存活率均低于空白组，且5组细胞存活率随着尼古丁质量浓度的增加而降低。0.8、1.6mg·mL-1组细胞存活率分别为空白组的77%和32%，其差异均有统计学意义（P＜0.05）。为防止过低的细胞存活率给后续实验带来假阴性误差，本研究选取X= 0.8mg·mL-1。

2.3 大蒜素对尼古丁氧化毒性作用的影响

不同质量浓度大蒜素及尼古丁作用后各组吸光度值A与HPDLCs存活率见表2。如表2所示：A1、A2组细胞存活率虽略高于同板尼古丁组，但其差异无统计学意义。A3组HPDLCs存活率为N3组的112%，其差异有统计学意义（P＜0.05）。A1、A2组细胞存活率分别为同板空白组的81%、80%，其差异有统计学意义（P＜0.05），而A3组细胞存活率与C3组接近，其差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究的后续实验选用大蒜素的质量浓度Y=60μg·mL-1。

表1 不同质量浓度尼古丁作用24 h后各组吸光度值A及细胞存活率Tab 1 The absorptiometries（A）and the survival rate after the 24 h culture with nicotine of different concentrations

表2 不同质量浓度大蒜素及尼古丁作用24 h后各组吸光度值A及细胞存活率Tab 2 The absorptiometries（A）and the survival rate after the 24 h culture with allicin and nicotine of different concentrations

2.4 尼古丁和大蒜素共同作用后不同时间点HPDLCs中GSH浓度

尼古丁和大蒜素共同作用后不同时间点HPDLCs中GSH浓度的测量结果见表3。组间比较：各时间点N组GSH浓度均低于A组和C组，且差异有统计学意义（P＜0.05）；而A组和C组的差异均无统计学意义（P＞0.05）。培养8 h时，N组GSH浓度达到最低，仅为C组的52%，而A组浓度较N组升高82%。组内比较：N组GSH浓度呈现“先降后升再降”的趋势，且每相邻2个时间点的浓度差异均有统计学意义（P＜0.05）；而A和C组各时间点间GSH浓度无明显变化（P＞0.05）。

表3 尼古丁和大蒜素共同作用后各时间点HPDLCs中GSH浓度Tab 3 The GSH concentrations in HPDLCs at time points after the culture of nicotine and allicin μmol·L-1

3 讨论

在对牙周病的研究中，尼古丁对HPDLCs的氧化损伤已经引起了学者们的广泛关注。研究[5]发现：吸烟后牙周局部的尼古丁质量浓度可达1.6mg·mL-1。尼古丁会使细胞内的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）陡增，消耗GSH等抗氧化物质[2]，从而启动凋亡信号，导致细胞凋亡[6]。本研究旨在探讨大蒜素这一抗氧化剂是否能改善尼古丁对HPDLCs的氧化毒性，为临床采用大蒜素治疗牙周病提供依据。参考其他学者[7-8]的实验，本研究确定大蒜素的质量浓度为15、30、60μg·mL-1。

WST-1是MTT的升级产品，其原理与传统MTT法相似，但拥有更高的灵敏度和更宽的线性范围。WST比色法的细胞存活率计算公式为：细胞存活率=调零后待测组A值/调零后空白组A值×100%，此公式与传统的MTT法所用公式相同。

本实验发现：除0.1mg·mL-1组外，各组HPDLCs存活率均低于空白组，且存活率随着尼古丁质量浓度的增加而降低；0.8mg·mL-1时细胞存活率降至空白组的77%。该趋势与Alpar等[1]的研究结果相近，再次证明了尼古丁对HPDLCs的氧化毒性，故认为建模成功。

ROS拥有未配对的活性电子，可夺取多数分子的电子来使自身稳定，同时产生新的自由基，进而启动链式反应造成细胞损伤。GSH被誉为“自由基清除器”，是细胞内抗氧化系统中的重要一环。GSH分子中的巯基（-SH）在提供1个电子后会优先两两结合，形成性质稳定的氧化型GSH，从而中断链式反应对细胞的损伤[6]。

Chang等[2]发现，尼古丁在降低HPDLCs存活率的同时会引起细胞内GSH的大量消耗，而加入GSH前体分子OTZ（2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid）后，不仅可使GSH浓度大幅度升高，细胞的存活率也显著升高。这提示：在尼古丁对HPDLCs的氧化毒性中，GSH的消耗起着关键作用。

本实验中，加入60μg·mL-1大蒜素后，HPDLCs存活率是尼古丁组的112%，接近对照组水平。与之对应的是，细胞内的GSH浓度也较尼古丁组在各时间点均有明显提高，接近对照组水平。这表明：大蒜素可以有效地抑制尼古丁对HPDLCs的氧化毒性，其机制与阻止细胞内GSH的消耗有关。

大蒜素是大蒜中提取出的活性成分，能显著减少多种细胞在应激后的ROS堆积和GSH消耗[7-9]，从而保护细胞。关于大蒜素降低ROS损伤的具体机制，笔者分析如下：大蒜素分子中含有1个S=O键，该键不稳定，易被打开，导致大蒜素自身的高温和碱不稳定性；当遇到ROS时，S=O键打开并提供2个自由电子，从而将2个分子ROS结合至自身；该反应形成的产物性质稳定，阻断了链式反应。

此外，在0.8mg·mL-1尼古丁单独作用的24 h内，HPDLCs中GSH浓度呈现先降后升再降的趋势，这与邹朝霞等[10]的研究果一致。原因如下：起始阶段由于ROS的氧化消耗，细胞内GSH减少，然后细胞自身的抗氧化调节使得GSH增加，到24 h时因细胞的部分死亡导致GSH再次减少。

值得注意的是，与本实验所提示的保护作用相反的是：有研究[11]显示10μg·mL-1的大蒜素单独作用即可造成多种成纤维细胞的死亡。笔者认为：后者是由于大蒜素直接作用于细胞内的凋亡信号通路所导致；而在本实验中，大蒜素优先与尼古丁所产生的ROS结合，两者间发生相互拮抗作用，没有触发凋亡信号通路，产生了保护效果。这一效果的具体作用机制有待进一步研究。

从本实验结果可以看出：常温下性质更稳定、释放更加持久的改良后的大蒜素可以运用于口腔临床中，为牙周病的治疗提供辅助方案。

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（本文编辑 胡兴戎）

Protective effect of allicin on human periodontal ligament cells with nicotine-induced oxidative damage

LI Bin-long,XIE Xiao-li,PENG Jie-ying,LUO Xiao-liang,JIN Lu-yuan.（Dept.of Oral Medicine,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha410008,China）

ObjectiveTo explore the protective effect of allicin on nicotine-induced oxidative damage to human periodontal ligament cells（HPDLCs）.Methods1）Establish nicotine-induced oxidative damage model on HPDLCs.Use water-soluble tetrazolium（WST）colorimetric method to find out the nicotine concentration（X）that could inhibit HPDLCs’growth for the following experiments.2）HPDLCs of the fifth passage were divided into 5 groups:The control group,the nicotine group and the nicotine+allicin groups（the concentration of allicin was 15,30,and 60μg·mL-1respectively）.Different kinds of culture media were added.Similarly,use WST colorimetric method to choose the allicin concentration（Y）that could significantly improve the survival rate of HPDLCs.3）HPDLCs were divided into 3 groups:The control group,the nicotine group,the nicotine+allicin group and different media were added.The glutathion（GSH）concentrations in HPDLCs were determined in 1,4,8,12 and 24 h respectively.Results 0.8mg·mL-1nicotine could inhibit the HPDLCs survival rate significantly（77%of the control,P＜0.05）.But 60μg·mL-1allicin could prevent the inhibition effects evidently,improving the survival rate to 112%of that of the nicotine group（P＜0.05）and reaching the survival rate level of control group（P＞0.05）.The GSH concentrations of nicotine+allicin group were higher than that of the nicotine group always（P＜0.05）and by 82%at 8 h after culture,but had no difference with that of the control group（P＞0.05）.Conclusion60μg·mL-1allicin can protect the HPDLCs against oxidative damage induced by nicotine.

human periodontal ligament cells； nicotine； oxidative damage； allicin； glutathion

R 781

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.003

1000－1182（2011）01－0009-04

2010-02-12；

2010-04-28

湖南省科技厅基金资助项目（2010FJ3067）；中南大学理科发展基金资助项目（1773-206001081）

李斌龙（1983—），男，山西人，硕士

谢晓莉，Tel：13973164578