人唾液α-淀粉酶与红/绿茶多酚相互作用的吸附动力学研究

林锋 姚江武

（厦门市口腔医院 修复科，厦门 361003）

人唾液α-淀粉酶与红/绿茶多酚相互作用的吸附动力学研究

林锋 姚江武

（厦门市口腔医院 修复科，厦门 361003）

目的 探索茶黄素（TF）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与人唾液α-淀粉酶（HSA）反应所引起的口腔收敛性感觉的驱动力。方法 利用表面等离子共振仪（SPR）和吸附动力学原理，测量Langmuir、Freundlich吸附等温线常数（KL、Kf和Mm）和吸附反应速率及平衡常数（ka、kd、KA和KD）。结果 TF和EGCG在2种模型下的相关决定系数之间的差异无统计学意义（P＞0.05），均适用于描述TF和EGCG的吸附现象。TF的吸附等温线常数、结合速率和结合平衡常数均大于EGCG（P＜0.05），解离速率和解离平衡常数均小于EGCG（P＜0.05）。结论 红茶中的TF比绿茶中的EGCG更易造成口腔黏膜强烈的收敛性感觉，其驱动力来源于多酚结构中的羟基的氢键结合和酰基的疏水性反应。

茶黄素； 表没食子儿茶素没食子酸酯； 表面等离子共振仪； 人唾液α-淀粉酶

红茶和绿茶是中国人最喜爱的两种茶，其有效成分为茶多酚。茶黄素（theaflavin，TF）和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）分别占红茶和绿茶茶多酚成分的12%和50%[1]。人唾液α-淀粉酶（human salivaryα-amylase，HSA）是水解淀粉和糖原酶类的总称，因其在口腔获得性膜的形成和生长过程中也发挥了重要作用，从而受到口腔研究者的广泛关注[2]。饮茶时口腔分泌的唾液蛋白质不足以中和茶多酚，则形成茶多酚-蛋白质沉淀物，并覆盖于口腔黏膜表面，产生干燥和皱缩感[2-3]，因此，茶多酚与唾液蛋白质反应并形成复合物的研究显得十分重要。在以往的研究中，茶多酚吸附于唾液蛋白质表面的分子水平上的报道十分罕见，近年来由于新方法的应用，如：椭偏仪、消散因子石英晶体微天平、表面等离子共振仪（surface plasmon resonance，SPR）等，使得茶多酚与蛋白质反应的研究达到了原位、实时和动态[4]。本研究利用SPR和吸附动力学原理，以TF和EGCG为红茶和绿茶中茶多酚的代表化合物，将其吸附于HSA表面，探索TF和EGCG与HSA反应所引起的口腔收敛性感觉的驱动力，为了解红茶和绿茶茶多酚引起口腔收敛性感觉的分子机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

HSA（批号EC3.2.1.1），N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），1、3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC]，PBST（phosphate bufferd saline with Tween 20）缓冲液（Sigma公司，美国）。≥98%TF（红茶提取物，Woko公司，日本）；99%EGCG（绿茶提取物，厦门勋健中药植物化学有限公司）。

SPR（SR7000DC型，Reichert公司，美国）；Millipore Direct-Q3超纯水器（Millipore公司，法国）。

1.2 组装HSA[5]

通入1mL的体积比为1∶1的0.2mol·L-1EDC和0.1mol·L-1NHS混合溶液，活化SPR芯片（CMD500m型）10min。注入1mL的HSA溶液至吸附达到稳态，再注入1mol·L-1pH 8.5的乙醇胺盐酸溶液1mL，维持封闭10min。排空乙醇胺，并通入20mmol·L-1pH 2.0的盐酸溶液以去除非特异性结合的HSA。至此，在活化的SPR芯片表面形成了由HSA组装的蛋白质生物膜。

1.3 SPR监测

在25℃、pH值为7.0、离子强度为10mmol·L-1PBST的条件下，分别注入不同质量分数（20、30、40、50、60μmol·L-1）的TF和EGCG溶液，大约30 min后吸附达到稳态，记录响应强度对时间的函数关系曲线。

1.4 芯片的再生[6]

通入0.1mol·L-1磷酸1mL，并保持2 min。当HSA表面吸附的多酚被移除后，系统响应强度将回到缓冲液基线水平。再生的芯片用于再吸附。

1.5 吸附等温线常数

Langmuir吸附等温线公式[7]：C/M=1/KLMm+C/Mm。Freundlich吸附等温线对数公式[8]：lg M=lg Kf+1/n lg C。上述2个公式中：C是被吸附溶液的浓度；M是吸附量；KL是Langmuir吸附常数，反映吸附过程的强度；Mm为饱和状态的最大吸附量；1/n是常数；Kf是Freundlich吸附常数，意义同KL。绘制C/M对C和lg M对lg C的等温线，由函数关系图得出直线的斜率和截距，求得吸附等温线常数KL、Mm、Kf和1/n。

1.6 反应速率和平衡常数

芯片上配体与分析物反应形成复合物的速率公式为[9]：d[AB]/d t=ka[A][B]-kd[AB]，即：d R/d t=kaCRmax-（kaC+kd）R。式中A是分析物TF和EGCG，B是传感片表面固定的配体HSA，AB为形成的复合物TF-HSA和EGCG-HSA，C为分析物TF和EGCG的质量分数，Rmax为芯片上形成最多复合物时所得到的响应，R为时间t时所得到的响应。以d R/d t对R作图可得到一条直线，其斜率即为表观吸附常数Kobs，且Kobs=-（kaC+ kd）。以-Kobs对C作图，同样可以得到一条直线，其斜率即为吸附反应速率常数ka，截距为解离反应速率常数kd。可根据关系式[9]：KA=ka/kd，KD=kd/ka，求得反应平衡常数（结合平衡常数KA和解离平衡常数KD）。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0软件对Langmuir和Freundlich模型吸附等温线相关决定系数（R2）、吸附等温线常数（KL、Mm和Kf）、反应速率及平衡常数（ka、kd、KA和KD）进行配对t检验，检验水平α=0.05。

2 结果

2.1 吸附模型的比较

不同浓度的TF和EGCG吸附于HSA表面的响应强度与时间的关系见图1。从图1可见，随着时间的推移，吸附响应强度逐渐增大，直到达到平衡；伴随着TF和EGCG的浓度增加，吸附响应强度也相应增大。

图1 不同浓度的TF和EGCG吸附于HSA表面的响应强度与时间的关系Fig 1 The response unit versus time response for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces at various TF and EGCG concentrations

TF和EGCG吸附于HSA表面的动力学模型的相关决定系数比较见表1。统计分析表明，TF和EGCG在2种模型下的相关决定系数之间的差异无统计学意义（P＞0.05），表明Langmuir和Freundlich吸附模型均适用于描述TF和EGCG的吸附现象。

表1 TF和EGCG吸附于HSA表面的动力学模型的相关决定系数比较Tab 1 Com parison of the correlation coefficient of determ ination for the kinetic model for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces

2.2 吸附等温线常数的比较

TF和EGCG吸附于HSA表面的Langmuir和Freundlich吸附等温线见图2。根据图2求得的吸附等温线常数（KL、Mm和Kf）见表2。结果显示，TF的吸附等温线常数均大于EGCG（P<0.05），表明TF与HSA的亲合性高于EGCG。

图2 TF和EGCG吸附于HSA表面的Langmuir（上）和Freundlich（下）吸附等温线Fig 2 Adsorption isotherm of TF and EGCG adsorption on HSA surfaces fitted to the Langmuir model（up）and the Freundlich model（down）

表2 TF和EGCG吸附于HSA表面的吸附等温线常数（K L、M m和K f）的比较Tab 2 Com parison of the constants of adsorption isotherm（K L，M m and K f）for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces

2.3 反应速率及平衡常数的比较

根据速率公式绘制图3，反应速率常数（ka和kd）和反应平衡常数（KA和KD）的统计结果见表3。结果显示：TF的结合速率和结合平衡常数均大于EGCG（P<0.05），解离速率和解离平衡常数均小于EGCG（P<0.05），表明TF与HSA反应形成复合物的速度大于EGCG，且吸附反应达到平衡后形成复合物的量也大于EGCG。TF和EGCG的结合速率比解离速率分别高5和4个数量级，而结合平衡常数分别比解离平衡常数分别高9和7个数量级，表明TF和EGCG吸附于HSA表面的结合反应是可逆的，但是可逆的程度很弱，且TF与HSA的结合比EGCG更紧密些，即TF与HSA的亲合性高于EGCG。

图3 表观吸附常数与TF和EGCG浓度的关系Fig 3 The relation between the apparent adsorption constant and TF/EGCG concentrations

表3 TF和EGCG吸附于HSA表面的反应速率（k a和k d）及平衡常数（K A和K D）的比较Tab 3 Com parison of the rate（k a and k d）and equilibrium constants（K A and K D）of the reaction for TF and EGCG adsorption on HSA surfaces

3 讨论

3.1 TF和EGCG膜的特性

固体-液体界面的吸附过程可用Langmuir和Freundlich模型描述。Langmuir模型认为吸附层是单层膜，一个吸附剂分子与一个吸附质分子对应结合，它代表了均匀的表面吸附分子间彼此没有相互作用的情况下，单分子层吸附达到平衡时的规律[8]。Freundlich模型是一个经验式，除了适用于单分子层吸附，也可应用于多分子层和表面不均匀的吸附过程[8]。本实验结果证实：Langmuir和Freundlich模型均能用于描述TF和EGCG的吸附过程，因此可以初步判断：1）HSA表面吸附的TF和EGCG膜为单层膜，且一个TF或EGCG分子与一个HSA分子对应结合；2）可以用2种吸附模型的等温线常数判断TF和EGCG吸附于HSA表面的亲和性。反应速率常数的统计结果表明：TF和EGCG在HSA表面形成单层膜的速度非常快，且TF大于EGCG，提示饮用红茶后，其成分中的TF将比绿茶中的EGCG更迅速地吸附于口腔黏膜表面，形成茶多酚单层膜，从而启动口腔黏膜强烈的干燥和皱缩的收敛性感觉。而TF单层膜从HSA表面解离下来的速度非常小，则表明TF单层膜的稳定性大于EGCG，饮用红茶造成的收敛性感觉的持续时间将比绿茶长。

3.2 TF/EGCG与HSA的亲和性

亲和性常数从不同角度描述了TF和EGCG与HSA的亲和性：Langmuir和Freundlich吸附常数（KL和Kf）反映了亲和性反应的激烈程度；饱和状态的最大吸附量（Mm）反映了与HSA结合后生成TF和EGCG单层膜的量；反应平衡常数（KA和KD）则从饱和吸附状态描述了亲和性反应过程。各常数的统计结果（表2、3）表明：TF与HSA之间的亲和性大于EGCG，这是由于：1）TF为红茶多酚的多聚体，分子结构中有9个羟基，而EGCG为绿茶多酚的单聚体，分子结构中有8个羟基。由于羟基能够与HSA分子的活性中心裂隙处的氨基酸极性基团（酰胺、胍、肽、氨基、羧基）发生氢键结合，因而分子结构中羟基多者，与蛋白质的亲和性更好[10]；2）TF亚类TF-3有2个酰基，TF-2A和TF-B各有1个酰基，而EGCG没有酰基，一方面酰基能与HSA蛋白质分子中疏水性的氨基酸产生疏水性作用[11]；另一方面酰基能够为位于HSA蛋白质（-3）/（-2）、（-1）/（+1）、（-1）/（+2）位点的色氨酸59、酪氨酸62、151残基提供TF积聚反应的条件[12]；3）TF的相对分子质量大于EGCG的相对分子质量[13]，就同一蛋白质而言，大分子量的茶多酚为蛋白质结合能够提供较多的结合位点，因而与蛋白质的亲合性就好[14]。TF和EGCG与HSA的亲和性比较结果表明：红茶中的TF比绿茶中的EGCG更易与HSA结合形成多酚-HSA复合物，覆盖于口腔黏膜表面会造成强烈的干燥和皱缩感，覆盖于牙齿表面形成色素生物膜会影响美观。

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（本文编辑 李彩）

Adsorption kinetic study of the interaction between human salivaryα-amylase and the polyphenoles from the black/green tea

LIN Feng,YAO Jiang-wu.（Dept.of Prosthodontics,Dentistry Hospital of Xiamen City,Xiamen361003,China）

ObjectiveTo explore the driving force of the oral astringency produced by the interaction of theaflavin（TF）and epigallocatechin-3-gallate（EGCG）to human salivaryα-amylase（HSA）.MethodsThe constants of the rate,equilibrium of reaction（ka,kd,KA,andKD）and Langmuir,Freundlich adsorption isotherm（KL,Kf,andMm）were determined by surface plasmon resonance（SPR）technique and adsorption kinetics.Results Both of Langmuir and Freundlich models could be used for describing the binding processes of TF and EGCG onto HSA surfaces,and there were no significant differences of the correlation coefficient of determination between these two models（P＞0.05）.The constants of adsorption isotherm,the rate and equilibrium constants of the association for TF were higher than those of EGCG（P＜0.05）.The rate and equilibrium constants of the dissociation for TF were lower than those of EGCG（P＜0.05）.The affinity of TF to HSA was higher than that of EGCG.ConclusionThe sorely oral astringency is much easily produced by TF from the black tea rather than EGCG from the green tea.The driving force of the oral astringency is attributed to the hydrogen bonds of hydroxyl groups and hydrophobic interaction of galloyl groups in polyphenolic structures.

theaflavin； epigallocatechin-3-gallate； surface plasmon resonance； human salivaryα-amylase

R 783.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.002

1000－1182（2011）01－0005-04

2010-03-10；

2010-06-25

林锋（1975—），男，福建人，主治医师，硕士

林锋，Tel：13063048749