胶原-羟磷灰石复合膜引导骨组织再生的动物实验研究

金琼王晓敏 王晓飞 李旭东 麻健丰

（1.温州医学院附属口腔医院 口腔修复科，温州 325027；2.四川大学 生物材料工程技术研究中心，成都 610064）

胶原-羟磷灰石复合膜引导骨组织再生的动物实验研究

金琼1王晓敏2王晓飞1李旭东2麻健丰1

（1.温州医学院附属口腔医院 口腔修复科，温州 325027；2.四川大学 生物材料工程技术研究中心，成都 610064）

目的 探讨自制胶原-羟磷灰石（COL-HA）复合膜修复SD大鼠颅骨缺损的效果。方法 在24只SD大鼠的颅顶骨上各制备4个缺损，其中左、右侧缺损区分别覆盖COL-HA复合单层致密膜（第2组）和COL-HA复合双层膜（第3组），额骨缺损区保留作为空白对照（第1组），枕骨缺损区覆盖Bio-Gide膜作为对比（第4组）。术后2、4、8、12周各处死6只大鼠取材，进行肉眼观察、X线检查、组织切片观察和新生骨量测定，对结果进行广义线性模型/析因设计方差分析和LSD-t检验。结果 从术后2周开始除第1组外，其余3组均可见少量新生骨质，12周时3组缺损区由不透明硬组织封闭，并可见分解的部分膜碎片。X线显示，术后12周时第3组和第4组缺损区修复骨密度与原骨质接近，第2组稍低。新生骨量分析显示，术后初期第4组新生骨量大于其余3组，术后12周第4组与第3组和第2组的成骨量无统计学差异。结论 COL-HA复合膜能引导大鼠颅骨组织再生，且复合双层膜成骨效果要优于复合单层致密膜，其结构更有利于成骨细胞的附着和生长。

引导骨组织再生； 胶原； 羟磷灰石； 骨缺损

种植术前骨量不足和种植术中、术后种植体周围骨缺损是影响种植成功率的主要因素。近年来，膜引导骨组织再生（guide bone regeneration，GBR）技术的运用使上述问题得到了解决，大大提高了种植成功率，扩大了口腔种植的适应证[1-2]；膜材料的性能亦成为口腔种植学研究的热点。羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）作为骨替代材料目前已被广泛接受，其不仅具有良好的生物相容性和生物活性，而且还具有骨传导性，能引导新骨从宿主骨沿植入界面向植入体内部生长，通过形成磷灰石层与周围骨组织形成良好的骨键合[3-4]，但HA单独使用时存在手术中不易塑形、固位难等问题。胶原（collagen，COL）膜已被证明是良好的GBR膜材料[5]，与HA复合可增加HA的固位，同时可提高膜的强度，且无机相的羟磷灰石具有良好的骨引导能力，可促进骨组织的再生[6-7]。

本实验采用原位矿化纤维凝胶途径制得COLHA复合单层致密膜和COL-HA复合双层膜，使其具有与自然骨相似的成分和结构，并与Bio-Gide膜的成骨效果进行比较，探讨原位矿化纤维凝胶COLHA复合膜材料应用于临床的可行性和引导骨组织生成的效果。

1 材料和方法

1.1 实验材料

COL-HA复合单层致密膜（厚0.04 mm，直径8mm）和COL-HA复合双层膜（厚0.20～0.30mm，直径8mm）由四川大学生物材料工程技术研究中心研制提供。Bio-Gide膜（Geistlish公司，瑞士）。

1.2 动物模型

选取健康的3月龄SD雄性成年大鼠24只（重为420～480 g），按每100 g重量给10%水合氯醛0.3mL腹腔注射麻醉。剪除颅顶部的毛发，消毒，铺巾，沿头颅正中做切口，在骨膜下向两侧翻瓣，用种植机配直径5mm的空心钻在生理盐水冲洗冷却下，于SD大鼠颅顶骨上制备4个直径5mm的圆形贯通骨缺损，2个骨缺损边缘间距为2～3mm，术中勿伤及下方硬脑膜。在4处骨缺损区中，左、右侧骨缺损区分别覆盖COL-HA复合单层致密膜（第2组）和COLHA复合双层膜（第3组），额骨缺损区保留作为空白对照（第1组），枕骨缺损区覆盖Bio-Gide膜作为对比（第4组），将膜与骨面贴合，严密缝合（图1）。术后3 d，每天2次予以肌肉注射庆大霉素2万单位抗感染。

1.3 实验观察与测试

分别在术后2、4、8、12周各处死6只大鼠，完整切取颅顶骨，进行肉眼观察，并用10%甲醛固定24 h，进行X线检查，每次检查时都由同一名技师拍片，再将标本置入20%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液中脱钙，沿缺损中央分切，然后水洗、脱水、石蜡包埋，制作5μm的连续切片12张，其中4张用于常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosine，HE）染色，8张用于改良Masson染色，光镜下观察。采用图像分析软件Image-Pro Plus6.0对Masson染色结果进行新生骨定量分析，随机选取每组各时间点切片3张，每张切片随机选取3个40倍视野，测量积分光密度（成骨量）和新骨面积。

图1 大鼠颅骨缺损模型制备Fig 1 Preparation of rat cranial defect model

1.4 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行广义线性模型/析因设计方差分析和LSD-t检验，检验水平α= 0.05。

2 结果

2.1 肉眼观察

所有创口均为Ⅰ期愈合，无1例发生术后感染或排异反应。

术后2周：第2、3、4组膜形态均完整连续，缺损边缘生成较多稚嫩纤维组织，缺损中央为半透明纤维膜封闭，3组之间无明显差异。第1组缺损区周围可见增生的肉芽组织。

术后4周：第2组膜形态不清晰，破碎呈湿沙状，与肌层粘连，外表纤维包裹较厚，周围长入大量肉芽组织，缺损中央为半透明纤维膜封闭；第3组膜形态不清晰，破碎呈泥状，其余表现同第2组；第4组膜形态隐约可见，与骨组织部分融合，表面与肌层粘连，缺损区由不透明骨样组织封闭，针刺稍有阻力；第1组纤维覆盖缺损区，周围长入大量增生的肉芽组织。

术后8周：第2组和第3组膜的形态消失，呈小颗粒碎渣，缺损区由不透明骨样组织封闭，边缘不清晰，探针刺入阻力大；第4组膜形态不清晰，与骨组织融合，质地较坚韧，缺损区由不透明硬组织封闭，探针刺入困难；第1组缺损区由半透明纤维组织占据，针刺无阻力。

术后12周：第2、3、4组表现无明显差异，膜形态消失，但仍可见分解的部分膜碎片，缺损区由不透明硬组织封闭，边缘不清晰，针刺不入；第1组缺损部分由软组织封闭。

2.2 X线检查

术后2周除第1组呈现暗影外，其余3组骨缺损边缘均表现少量骨性阴影。随着愈合时间的增加，缺损区骨修复逐渐增多，12周时新骨生成最多，骨密度最高。术后12周：第2组修复骨影像呈云雾状，骨密度较原骨质低；第3组和第4组缺损区修复骨密度与原骨质接近；第1组浅表暗影，与原骨质分界明显（图2）。

2.3 组织学观察

术后2周：第2、3、4组骨缺损边缘可见少量新生骨质，新骨呈细的骨小梁及编织骨状态；第1组骨缺损内基本为纤维组织所占据，并可见炎症细胞浸润，缺损端少量成骨。

图2 术后2周（左）和12周（右）时的X线片Fig 2 X-ray films at 2 weeks（left）and 12 weeks（right）after surgery

术后4周：第2组骨缺损区编织状骨逐渐增多，骨小梁较细，新生骨向中央逐渐充填骨缺损；第3组缺损内可见较多新生的编织骨及板层骨；第4组缺损中央有大量新生骨质，大部分为编织骨，向中央逐渐充填骨缺损；第1组缺损断端有少量新生骨，致密纤维包裹（图3）。

图3 术后4周的组织学观察 Masson ×40Fig 3 Histological observation at 4 weeks after surgery Masson ×40

术后8周：第2组骨缺损的边缘虽有部分新骨生成，但中央区由束状胶原纤维连接；第3组新骨量增多，骨小梁也逐渐增宽，逐渐充填缺损区；第4组成骨明显增加，新生骨质更加成熟，新骨在缺损中央接近汇合；第1组缺损断端骨质致密化，为纤维所包裹（图4）。

术后12周：第2、3、4组均可见部分分解的GBR膜材料。第2组新生骨增多，并逐渐充填骨缺损区，骨质变成熟；第3组骨缺损区新生骨明显增多，骨小梁增宽，并向板层骨过渡，新骨在缺损中央部分汇合；第4组骨缺损区可见成熟的编织骨及板层骨，成骨明显增加，接近形成完整的骨桥连接；第1组骨缺损区可见新骨形成，骨小梁较细，表面由纤维包裹（图5）。

2.4 成骨量和成骨面积的定量分析

各实验组术后不同时间点的成骨量见图6。对各组成骨量进行统计分析，结果表明：术后2周第4组成骨量明显大于第1组和第2组；术后4周第4组成骨量明显大于其他3组；术后8周第4组成骨量明显大于其他3组，第3组明显大于第1组；术后12周第4组成骨量大于第1组，与第3组和第2组无统计学差异。他3组，第3组大于第1组；术后12周第4组成骨面积大于第1组，与第3组和第2组无统计学差异。

图6 各实验组术后不同时间点的成骨量Fig 6 Quantify of regenerate bone at different time points in four groups

各实验组术后不同时间点的成骨面积见图7。统计分析表明，术后2周各组成骨面积无明显区别；术后4周第4组成骨面积明显大于第1组和第2组，第3组大于第1组；术后8周第4组成骨面积明显大于其

图7 各实验组术后不同时间点的成骨面积Fig 7 Area measurement of regenerate bone at different time points in four groups

3 讨论

本实验使用的大鼠为3月龄的SD雄性成年大鼠。在一般的开放饲养条件下，大鼠的寿命为2.5～3年，无菌大鼠寿命可达4年。以人60岁为老年年龄，大鼠进入老年的相应时间为1.7年，即20个月。成年大鼠一般常用2～12月龄者，处于成年期的大鼠整体机体机能都处于最佳的状态。虽然雌雄各半实验组更具有群体的代表性，但考虑雌性大鼠激素水平不同可能存在骨组织代谢的差异，同时参考学者[5，8-9]的实验研究，选择成年雄性SD大鼠来制作实验模型。

下颌骨是骨缺损研究的常用模型，但是大鼠下颌骨比较薄，为2个相融的皮质骨板，缺乏骨髓骨源性细胞和生长因子，且植入物固位较困难，同时下颌切牙根较长，弯至下颌骨体，易被损伤，很不易操作；而颅骨结构与下颌骨类似，在胚胎学上均为膜内成骨方式成骨；在解剖学上，颅骨为两层皮质骨内间隔骨松质；在生理上，颅骨的皮质骨类似于萎缩的下颌骨。因此，颅骨是检测下颌骨缺损修复材料修复效果的常用部位[10]。Busch等[8]为评价大鼠顶骨直径5 mm的缺损是否可靠，在5～6月龄雄性Wistar大鼠双侧顶骨避开矢状窦，各造成一个5mm的骨缺损，术后6及12个月时发现除了缺损边缘有极少量骨形成外，并未出现自发性骨再生现象。本实验选择在成年雄性SD大鼠颅骨上造成5mm的圆形骨缺损，术后12周时空白对照组缺损内大部分为纤维组织占据，阻止了缺损内成骨性细胞的成长，很难自行达到骨愈合。这说明：利用SD大鼠颅骨缺损模型研究检测骨修复材料成骨效果，具有实际指导意义。

COL-HA复合膜是基于矿化胶原纤维凝胶的复合类骨材料研究方法所制得的，同时结合了胶原自组装形成纤维网络凝胶和羟磷灰石的原位矿化，所制得的膜具有良好的机械性能[11]。COL-HA复合单层致密膜和复合双层膜的拉伸强度分别为（53.40± 8.80）MPa和（2.50±0.28）MPa，湿态强度为（1.86± 0.40）MPa和（0.21±0.07）MPa[12]，并具有一定的空间维持能力。前期体外成骨细胞培养结果表明，COLHA复合膜具有良好的生物相容性，细胞在材料表面生长形态良好。在本实验中COL-HA复合膜在植入后8周开始分解，12周组织切片仍可见部分膜分解碎片，未见明显的炎症细胞浸润。作为一种可吸收的GBR膜材料，它必须要有适宜的降解时间以维持足够长的时间（最少6周）引导缺损区新骨生成，过早分解会使得原本被GBR膜所隔离的纤维细胞重新爬入骨缺损区，阻碍新生骨生成，影响成骨效果[13]。本研究中COL-HA复合膜在术后12周仍未完全分解，说明它具有良好的降解性能，有利于引导骨组织生成，且材料及降解产物不会引起周围组织的不良反应，生物相容性良好。

本实验中对切片不但进行了HE常规染色，还进行了Masson染色。因组织成分的不同，将骨基质染成红色，骨髓染成黄色，纤维组织染成蓝色，借此明确识别骨缺损中的组织[14-15]。在计算机辅助图像分析系统上能方便指出新骨结构，测量更加客观。本研究表明，第2组和第3组的成骨面积和成骨量无明显差异。术后初期第4组新生骨量明显大于第1、2组，但从术后12周第2组和第3组的新生骨量明显增加，与第4组的差异不再有统计学意义。COL-HA复合双层膜组新生骨略大于COL-HA致密膜组，但并不具有统计学差异，这可能是由于COL-HA复合双层膜一侧致密光滑，一侧多孔疏松。致密层可以将成纤维细胞阻挡于膜外，发挥GBR膜的屏障作用，而疏松层具有多孔结构，与组织的接触面积更大，比致密膜具有更强的钙磷释放能力，同时源自骨膜或骨髓的骨生成细胞更易于在多孔膜表面贴附，增殖分化为成骨细胞，成骨细胞沿膜内表面爬行，分泌类骨基质，并在复合膜释放钙的环境下逐渐矿化[11]，形成细胞外基质，从而使骨缺损得以愈合。但在本实验中两者差异尚不具有统计学意义。

本实验中第2、3、4组均采用缺损区外层单面盖膜，如图5组织学切片所示，术后12周大部分样本未达到完全骨性愈合。这可能是由于缺损区内侧未盖膜，使得脑组织突入缺损内，影响了骨组织修复。该结果与李树春等[9]研究骨形态发生蛋白与胶原膜复合物修复大鼠颅骨缺损实验的结果相符，他们采用双侧覆盖复合膜和外侧单面覆盖复合膜进行平行对照，结果术后4、6周双侧盖膜组的成骨百分比明显大于单侧盖膜，且双侧盖膜组在术后6周已达骨性愈合。因此在以后的动物实验中可考虑增加双侧盖膜组进行对比。

本研究表明，COL-HA复合膜作为可吸收性GBR膜，具有良好的生物相容性及机械性能，且COL-HA复合双层膜的引导骨组织修复能力优于复合单层致密膜，具有更好的临床应用前景。但COLHA复合双层膜的引导骨组织再生作用仍稍逊于Bio-Gide膜，其原因有待更深入的研究，以进一步改善COL-HA复合膜的性能。

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（本文编辑 李彩）

The efficacy of collagen-hydroxyapatite com posite membrane on bone regeneration

JIN Qiong1,WANG Xiao-min2,WANG Xiao-fei1,LI Xu-dong2,MA Jian-feng1.（1.Dept.of Prosthodontics,Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical College,Wenzhou325027,China;2.Biomaterial and Engineering Research Center in Biomaterial,Sichuan University,Chengdu610064,China）

ObjectiveTo investigate the efficacy of a new collagen-hydroxyapatite（COL-HA）composite membrane on bone regeneration of SD rat cranial defects.MethodsFour defects were produced in the calvaria of 24 SD rats.The animals were divided into four groups:Empty defects without membrane（group 1）;defects covered by COL-HA single-layer dense membranes（group 2）;defects covered by COL-HA double-layer membranes（group 3）; defects covered by Bio-Gide membranes（group 4）.At 2,4,8 and 12 weeks after surgery,6 rats were sacrificed and the following parameters were analyzed:Macroscopic observation,X-ray examination,descriptive histology,regenerate bone quantitative histology.Statistical analysis consisted of generalized linear models/factorial design analysis of variance and LSD-ttest was performed.Results Since two weeks after surgery,there were a small amount of bone regenerated in three groups except group 1.At 12 weeks after surgery,the opaque sclerous tissues filled with the defects in three groups,and residual membrane fragments still could be found.X-ray pictures showed the density of regenerate bone in group 3 and group 4 was closed to the original bone and greater than that of group 2. Quantitative analysis of regenerate bone showed that in initial stage,group 4 had more bone regeneration than the other groups（P<0.05）,and at 12 weeks after surgery the differences between group 4 and group 2/group 3 had no statistically significant.ConclusionThe COL-HA composite membranes can guide bone regeneration of rat cranial defects.The efficacy of bone regeneration of COL-HA double-layer membrane is superior to COL-HA single-layer densemembrane,because its property ismore propitious to the adherence and proliferation of osteoblasts.

guide bone regeneration； collagen； hydroxyapatite； bone defect

1000－1182（2011）01－0021-06

Q 81

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.006

2010-03-09；

2010-06-25

金琼（1984—），女，浙江人，硕士

麻健丰，Tel：0577-88063033

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