禽呼肠孤病毒σ2基因的真核表达及其免疫效果研究

邓显文，谢芝勋，谢丽基，谢志勤，刘加波，庞耀珊

（广西兽医研究所，广西 南宁 530001）

禽呼肠孤病毒（ARV）广泛存在于世界范围内的商品肉鸡群中，可感染鸡、火鸡及一些鸟类[1]，临床上主要引起鸡关节炎/腱鞘炎、吸收障碍综合症、矮小综合症和呼吸道病等多种疾病，造成很大的经济损失[1-2]。

ARV的基因组为双股RNA（dsRNA），由大（L）、中（M）和小（S）三组共 10个节段基因组成[3]。S组有S1、S2、S3、S4四个基因，其中S1基因编码的σ3蛋白是外壳蛋白中最小的一种蛋白，携带有ARV的特异性中和反应的表面抗原，能刺激机体产生保护性的中和抗体[4-5]，该蛋白还是一种细胞吸附的特异性蛋白，能够特异地吸附到禽类细胞上[6]。由S2基因编码的σ2蛋白与σ3蛋白一样，都是病毒的外壳蛋白之一，拥有367个氨基酸，携带有群特异型中和抗原决定簇。σ2通过σ3作用，提高感染细胞上的能力，并在病毒的致病机理上起着一定的作用[7]。一些研究者据此进行了不同类型ARV疫苗的探索，包括灭活疫苗、弱毒苗和亚单位疫苗等[8-9]。DNA疫苗是将编码目的抗原蛋白基因序列的真核质粒导入机体细胞，通过宿主细胞的转录和翻译系统合成抗原蛋白，表达出的抗原蛋白经MHC I类和II类分子提呈免疫系统，诱发机体产生特异性体液免疫和细胞免疫反应，其抗原表达可持续数月[10-11]。因此，DNA疫苗具备类似自然感染的优点，成为研究的热点课题。本研究将ARV S1133毒株和广西分离株R1的编码σ2蛋白的基因克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体，用抽提、纯化的重组质粒DNA进行多点肌肉注射的SPF鸡，应用PCR检测pCDNA3.1+-S1133-σ2和 pcDNA-R1-σ2阳性重组质粒的存在，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 ARV S1133毒株由美国康州大学Khan博士惠赠，宿主菌JM109，广西分离株R1[12]，为本室保存。pcDNA3.1（+）真核表达载体购自Promega公司。

1.1.2 主要酶与试剂 Taq DNA聚合酶、RT-PCR试剂盒和限制性内切酶Eco R I、Xho I购自大连宝生物公司。M λDNA/Eco R I+Hind Marker，低分子量蛋白Marker，T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自Promega公司。羊抗鸡IgG和Trizol抽提试剂购自GIBCOL公司。禽呼肠孤病毒阳性血清购自哈尔滨兽医研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据ARV毒株S1133 S2基因序列[U20642]设计合成了一对跨越σ2蛋白基因的特异性引物。上游引物序列为XZ141：5’-GCGAATTCGCGCAAGCCGCAATGGAG-3’；下游引物 序 列 为 XZ142：5’-GCTCGAGTGACCCGGAGGTACCTTA-3’。两引物的5’端分别含有Eco R I和Xho I酶切位点，扩增的目的片段长为1 146 bp。引物由大连宝生物公司合成，用TE Buffer配成适当浓度，贮存于-20℃备用。

1.2.2 ARVσ2蛋白基因的获取 （1）RNA的提取：参照GIBCOL公司RNA提取试剂盒操作说明。（2）RT-PCR扩增ARVσ2基因：反转录合成cDNA，建立如下反转录体系，总反应体积为20μL，RNA 为 2 μL（约 20 μg），4 μL 8 mM MgCl2，2 μL 10×PCR缓冲液，2μL 10 mM dNTP（4种碱基），1 μL RNA抑制剂，1μL随机引物，1μL Mulv反转录酶，用无Rnase水加至总体积为20μL，离心均匀，于 25 ℃ 10min，42℃ 60min，99℃ 5min，4℃结束cDNA合成，供PCR扩增备用。（3）σ2基因的PCR扩增：采用100μL反应体系，即在20μL cDNA管中加入 4 μL 8 mM MgCl2，8 μL 10×PCR 缓冲液，600 ng上游引物和下游引物，0.5μL（2.5单位）Taq DNA聚合酶，用无菌水加至总体积为100 μL，首先 94℃ 5 min，然后进入 94℃ 1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min的循环，循环35次后，最后72℃延伸10min结束，4℃保存。

1.2.3 重组表达载体的构建与鉴定 用DNA片段回收试剂盒，切胶回收目的片段，经Eco R I和Xho I双酶切，取纯化的ARVσ2蛋白基因产物按2∶1的比例与经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1（+）混匀，反应体系为 10×buffer 1 μL，PCR 回收产物（200mg/L）2 μL，pCDNA3.1+载体（100mg/L）1 μL，dH2O 6μL。16℃连接过夜（16 h）。吸取10μL连接产物，分别加入到200μL JM109α（CaCl2法制备）的感受态细胞中，随后冰浴30 min，42℃ 1.5 min，冰浴1～2min，加入800μL无Amp的LB培养液于37℃摇床振荡培养45min。然后吸100 uL均匀涂布于含有Amp（终浓度为100 mg/L）的LB琼脂平板上，待液体吸干后37℃预热20 min，倒置平板，于37℃培养过夜。挑选呈白色菌落的重组质粒，经PCR初步鉴定后，用Eco RⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，将鉴定的ARV S1133、广西分离株R1的阳性重组质粒命名为 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2。分别提取阳性菌落的质粒DNA测序。

1.2.4 免疫疫苗的制备 （1）pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2：将阳性重组质粒划线于含有Amp的LB琼脂平板上，挑取单个菌落在含Amp（终浓度为100mg/L）的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA。经紫外分光光度计测定OD260值，计算重组质粒DNA 的浓度。（2）σ2蛋白：ARV σ2结构蛋白采用广西兽医研究所已构建好的质粒菌，参照谢芝勋等[13-14]介绍的方法表达、鉴定并且纯化，加入弗氏佐剂制备而成。（3）ARV灭活苗：由本实验室灭活ARV S1133，加入弗氏佐剂制备而成。

1.2.5 免疫保护试验 （1）试验鸡分组及免疫接种：试验前随机抽取5只SPF鸡，剖杀取关节、肝、肾、脾、法氏褰、胸腺、脑等7个部位样品，处理[11]抽提核酸后，参照谢芝勋[12]的方法进行RT-PCR检测。试验设 pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1组、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2 组、灭活苗免疫组、σ2蛋白组及空白对照组。pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1组、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2组：按 40 μg的剂量免疫14日龄SPF鸡（各15只）2次，每次间隔一周，采用多点肌肉注射。灭活苗免疫组：各取0.1mL的ARV灭活苗经颈部皮下免疫14日龄SPF鸡（15只）2次，每次间隔一周。σ2蛋白免疫组：按100μg的剂量经颈部皮下免疫14日龄SPF鸡（15只）2次，第一次免疫时加入等量的弗氏完全佐剂，第2次免疫时加入等量的弗氏不完全佐剂。空白对照组（15只）：注射0.1mL的生理盐水。（2）免疫鸡血清的 Western-blotting 分析：pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫组及空白对照组免疫前和第2次免疫后2周，采血收集血清，参考文献[13]进行Western-blotting分析。（3）试验鸡的RT-PCR检测 ：pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 组、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2组、灭活苗免疫组、σ2蛋白免疫组及空白对照组第2次免疫后2周，试验鸡经爪垫攻毒10倍稀释的ARV S1133株鸡胚尿囊液0.1mL。攻毒第3天开始扑杀试验鸡，分别在第3、5、7天采集关节、肝、肾、脾、胸腺、胰腺、法氏囊等7个部位样品，应用RT-PCR检测ARV S1133 RNA存在，统计结果，用Excel软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 ARVσ2基因的RT-PCR扩增

用引物XZ141和XZ142进行RT-PCR扩增，S1133、R1扩增产物电泳，由图1可见ARV S1133毒株和广西分离株R1扩增产物在1 146 bp处均有一条清晰的条带，与预期扩增目的基因大小相一致，说明引物设计合理，RT-PCR反应条件正确，成功扩增了σ2基因。

2.2 重组质粒的PCR、酶切和测序鉴定

用筛选的阳性重组质粒作为模板进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶分析PCR产物，扩增的目的片段与预期扩增目的基因大小相一致，约为1 146 bp，说明质粒初步鉴定为阳性质粒。取阳性重组表达质粒DNA进行Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，得到4 968 bp的载体DNA和1146 bp的σ2基因片段（见图2），说明目的基因已经插入到表达载体中，测序结果与GenBank数据库进行比较，表明插入的片段为σ2目的基因，表达σ2基因插入的位置，大小和阅码框架均正确。

2.3 Western-blotting结果

如图3所示，pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1组、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2组二免后收集的血清在71.3 kD左右有一特异条带，而对照组及pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫组免疫前收集的血清无此特异性反应，说明pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 组、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2 组免疫SPF鸡后能产生特异性血清。

2.4 免疫效果

用RT-PCR检测接种前扑杀鸡的关节、肝、肾、脾、胸腺、胰腺和法氏囊均未检出ARV RNA。用RT-PCR检测SPF鸡攻毒后的不同组织抽提的ARV RNA，检测结果见表1。从表中可看，空白对照组与灭活苗免疫组、pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1组 、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2组和σ2蛋白免疫组差异均显著（p<0.05）；σ2蛋白免疫组与 pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 组、pCDNA3.1+-R1-σ2免

表1 SPF鸡免疫后人工感染ARV后RT-PCR的检出率

疫2组差异显著（p<0.05），其中空白对照组与灭活苗免疫组、pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 组 、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2组和σ2蛋白免疫组差异均极显著（p<0.01）。σ2蛋白免疫组与pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1 组 、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2 组差异不显著（p>0.05）；pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1组 、与pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2组差异不显著（p>0.05）。灭活苗免疫组检出率为 5.7%，pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫1组检出率为11.4%，pCDNA3.1+-R1-σ2免疫 2组检出率为 10.5%，σ2蛋白免疫组免疫组检出率为8.6%，检出率均明显低于空白对照组，说明各免疫组的相应疫苗都发挥了免疫保护作用。在整个试验中，最高检出部位为关节、胸腺、胰腺和法氏囊检出率比较低。

3 结论与讨论

（1）根据ARV毒株S1133 S2基因序列[U2064 2]设计合成了一对跨越σ2蛋白基因的特异性引物XZ141和XZ142进行RT-PCR扩增，成功扩增了σ2基因，扩增的目的片段长为1 146 bp。回收σ2基因目的片段并克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）中，经PCR鉴定和Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，说明目的基因已经插入到表达载体中，测序结果与GenBank数据库进行比较，表明插入的片段为σ2目的基因的位置，大小和阅码框架均正确。

（2）pcDNA载体为含有tac启动子以及Amp抗性基因的真核高效表达载体，通过宿主细胞的转录系统合成目的蛋白抗原，诱导宿主产生对该蛋白的免疫应答，诱导出针对保护性抗原的特异性体液免疫和细胞免疫，从而达到预防和治疗疾病的目的[15]。本实验采用RT-PCR技术扩增完整的禽呼肠孤病毒ARVσ2基因，将其插入到真核表达载体pcDNA3.1（+）中，成功构建真核表达质粒。经抽提、纯化的重组质粒DNA进行多点肌肉注射的SPF鸡，应用RT-PCR技术在第7天仍能从注射肌肉部位、肝、关节检出 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2阳性重组质粒，说明了pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2能在鸡体内存活；用Western-blotting对免疫鸡血清分析表明，该阳性重组质粒能够诱导机体产生抗ARVσ2基因蛋白的抗体。

（3）在被检测的7种组织中，攻毒后关节的ARV RNA的检出率最高，其次为脾和肾，胸腺、胰腺和法氏囊检出率比较低，说明攻毒所用的ARV毒株对关节具有亲嗜性。

（4）本实验采用RT-PCR技术扩增完整的禽呼肠孤病毒ARVσ2基因，将其插入到真核表达载体pcDNA3.1（+）中，成功构建真核表达质粒pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2。用抽提的pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2重组质粒接种SPF鸡2次后，以ARV S1133毒株进行攻毒，使用RT-PCR方法对免疫鸡关节及内脏器官进行检测，从表1可看出，pCDNA3.1+-S1133-σ2免疫 1组检出率为 11.4%，、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫2组检出率为10.5%明显低于空白对照组（32.4%）（p<0.05），与灭活苗免疫组比较差异不显著（p>0.05），说明用构建的 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫SPF鸡，鸡只获得了较好的免疫保护。同时，pcDNA-σ2免疫组的检出率还稍微高于σ2蛋白免疫组的原因，是否是受重组质粒DNA免疫剂量、免疫途径或者σ2蛋白免疫剂量高的影响，重组质粒 pCDNA3.1+-S1133-σ2、pCDNA3.1+-R1-σ2免疫鸡能否有更好的免疫效果还有待于进一步研究。

（5）σ2蛋白是ARV外壳蛋白之一，携带有群特异型中和抗原决定簇，与σ2蛋白一样能刺激机体产生保护性的群特异性抗体，σ2通过σ3作用，提高病毒感染细胞的能力，在ARV的感染和致病作用上有着重要作用。通过对S1133、R1广西分离株σ2蛋白基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+），并证明了该重组质粒能诱导机体产生抗σ2基因蛋白的抗体，为进一步研究ARV免疫奠定了基础。

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