肽段连接的近红外荧光量子点对人颊鳞癌BcaCD885细胞侵袭和转移能力的影响

梅杰 杨凯 李志刚 曹雨庵

（重庆医科大学附属第一医院 口腔颌面外科，重庆 400016）

肽段连接的近红外荧光量子点对人颊鳞癌BcaCD885细胞侵袭和转移能力的影响

梅杰 杨凯 李志刚 曹雨庵

（重庆医科大学附属第一医院 口腔颌面外科，重庆 400016）

目的 研究肽段连接的近红外荧光量子点（QDs）对人颊鳞癌BcaCD885细胞的生长、侵袭、黏附和趋化运动能力的影响。方法 1）用表面连接穿膜肽段最大发射波长为800 nm的近红外荧光量子点（QD800）标记BcaCD885细胞（BcaCD885/QD800），用流式细胞仪检测QD800对BcaCD885细胞的标记率，用激光扫描共聚焦显微镜观察QD800在BcaCD885细胞内的分布情况；2）用不同浓度的QD800与BcaCD885细胞共培养，观察QD800对BcaCD885细胞生长的影响；3）用Transwell侵袭小室法和冲刷实验，比较BcaCD885/QD800和BcaCD885细胞侵袭、黏附和趋化运动能力的变化。结果 1）QD800对BcaCD885细胞标记后6 h时的标记率为94.07%，QD800主要分布在细胞质内；2）不同浓度的QD800均未影响BcaCD885细胞的生长情况；3）BcaCD885/QD800和BcaCD885细胞的侵袭、黏附和趋化运动能力无显著性差异（P＞0.05）。结论 用肽段连接的近红外荧光量子点标记BcaCD885细胞后不影响其生长、浸润和转移能力，为利用量子点进一步在活体条件下非侵入的体内肿瘤细胞成像和示踪研究提供了科学依据。

量子点； 近红外荧光； 黏附； 侵袭

发展对体内癌细胞非侵入可视化的监测方法对研究肿瘤的发生发展、早期诊断及治疗具有重大意义。由于新型纳米荧光探针量子点（quantum dots， QDs）与目前已有的有机荧光染料探针和荧光蛋白相比具有光稳定性好、荧光量子产率高等优良的光学特征，在对体内癌细胞非侵入长期示踪观察方面具有很大的发展前景[1]，特别是发射波长在近红外光范围内（700～900 nm）的量子点的荧光不仅对人体组织具有强的穿透力，同时也可避免组织自发荧光（400～600 nm）的干扰，特别适合行体内非侵入的医学成像。近年来证明：用具有穿膜作用的肽段表面修饰的QDs能提高对细胞的标记率[2]。虽然目前研究已表明生物化的QDs标记癌细胞后对细胞没有毒性，并且不影响其生长及分化[1，3]，但具有穿膜作用的肽段表面修饰的QDs大量标记进入癌细胞后是否影响其生长、浸润和转移等生物学行为这些关键问题目前还未见报道，这是用QDs标记癌细胞后进行非侵入可视化研究得到的结论是否科学的首要关键问题。本研究利用表面连有肽段，最大发射波长为800 nm的近红外荧光量子点QD800通过内吞作用标记人颊鳞癌BcaCD885细胞，观察被QD800标记后BcaCD885的生长、侵袭、黏附和趋化运动能力的改变情况。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

人颊鳞状细胞癌细胞株BcaCD885细胞（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室），QtrackerTM800 Cell Labeling Kit（Invitrogen公司，美国），Tcs-sp5激光扫描共聚焦显微镜（laser-scanning confocal microscope，LSCM）（Leica公司，德国），流式细胞仪（BD公司，美国），Z233MK-2冷冻低速离心机（Hermle公司，德国），Transwell侵袭小室（Costar公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 QDs对BcaCD885细胞的标记 QD800标记BcaCD885细胞根据QtrackerTM800 Cell Labeling Kit提供的实验步骤进行，简述如下：制备10 nmol·L-1的QD800标记液待用，将用胰蛋白酶消化后的Bca-CD885细胞移入EP管内，共1×106个细胞，然后加入0.2mL QD800标记液，吹打均匀后，置培养箱中共同培养1 h后冷冻低速离心5 min（1 000 r·min-1，4℃），弃去培养液，PBS冲洗细胞2次，洗掉未进入细胞内的QD800，然后再加入培养基继续培养6 h后，将QD800标记的细胞（BcaCD885/QD800）消化吹打成悬液，用流式细胞仪检测标记率。用LSCM观察QD800标记BcaCD885细胞后QD800在细胞内的分布情况。实验重复3次，取平均值计算标记率。

1.2.2 QDs对BcaCD885细胞生长的影响 将生长旺盛的BcaCD885细胞按每毫升2×104个的密度接种到4块24孔培养板内，每孔0.18mL，分为4组，培养24 h使细胞生长相对同步化后，对照组加入含15%小牛血清的PRMI1640培养液0.02mL，实验组分为A、B、C组，分别加入0.02mL不同浓度的QD800，使实验组A、B、C组所加入QD800后的终浓度分别为5、10、15 nmol·L-1，每天各组随机取3孔用0.1%胰酶充分消化，吹打细胞培养液，制成单细胞悬液，用血球计数板计算细胞，计算平均值，连续8 d，绘制细胞的生长曲线。实验重复3次，取其平均值。

1.2.3 QDs对BcaCD885细胞黏附力影响分析 按前面1.2.1实验方法分别制备密度为每毫升5×106个的BcaCD885/QD800和Tca8113细胞2组悬液，取24孔细胞培养板,每孔加细胞悬液0.2mL，每组12孔，分别于培养30、60、90、120min后各组随机取3孔弃去培养液，PBS液轻洗2遍，去除未真正黏附而贴附于孔底的细胞，0.25%胰酶消化后显微镜下计数，用下式计算不同时间的细胞黏附率：细胞黏附率=黏附细胞数/总细胞数×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 QDs对BcaCD885细胞侵袭力影响测定 按前面1.2.1实验方法将QD800与BcaCD885细胞共同培养，QD800浓度为10 nmol·L-1，培养1 h后，用0.1%胰酶充分消化后离心得到被QD800标记的BcaCD885细胞（即BcaCD885/QD800）。细胞侵袭重建基底膜实验在Transwell小室中进行，Transwell小室被孔径为8μm的聚碳酸多孔滤膜分为上下两室，在滤膜上下分别铺以15μg Matrigel，于37℃下重建1 h后备用。将BcaCD885/QD800和BcaCD885以2×105个细胞加入Transwell小室的上室中，37℃培养12 h，侵袭至滤膜下表面的细胞用苏木精-伊红染色后，随机选择5个400倍显微视野，重复3次，以平均数作为穿膜细胞数来表示BcaCD885细胞的侵袭能力。实验重复3次，取平均值。

1.2.5 QDs对BcaCD885细胞趋化运动影响分析 该实验与前面1.2.4实验的差异在于聚碳酸多孔滤膜表面未铺Matrigel，其余步骤和方法相同，仍随机选择5个400倍显微视野统计滤膜下表面的细胞数目，以细胞的相对数目来表示BcaCD885细胞的趋化运动能力。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 QDs对BcaCD885细胞的标记

QD800对BcaCD885细胞标记后6 h用流式细胞仪检测细胞的标记率为94.07%（图1），平均荧光强度为234.52。标记6 h后在LSCM下见BcaCD885细胞内有大量的QD800，主要分布在细胞质内（图2）。

2.2 QDs对BcaCD885细胞生长的影响

用不同时间各组细胞数绘制对照组和各实验组的生长曲线（图3），各实验组和对照组生长曲线无显著性差异。结果表明本实验中不同浓度的QD800未影响BcaCD885细胞的生长。

图1 流式细胞仪检测QD800标记BcaCD885细胞6 h后的标记率Fig 1 Flow cytometry detection of QD800 labeling of BcaCD885 cells at 6 h

图2 QD800进入BcaCD885细胞后分布在细胞质内 LSCM ×400Fig 2 QD800 distributes in the BcaCD885 cytoplasm LSCM ×400

图3 对照组和各实验组的生长曲线Fig 3 Growth curve of control group and each experimental group

2.3 QDs对BcaCD885细胞黏附性的影响

不同时间点BcaCD885/QD800和BcaCD885细胞的黏附率见表1，结果表明：经QD800标记后的Bca-CD885细胞其黏附能力未发生改变。

2.4 QDs对BcaCD885细胞侵袭能力的影响

铺在多孔滤膜表面上的Matrigel形成类似天然基底膜的结构，细胞穿过Matrigel的能力反映了该细胞的侵袭能力。实验发现：BcaCD885/QD800和Bca-CD885穿膜细胞均数分别为71.6±2.8、72.8±2.7，两均数间无显著差异（P＞0.05），表明经QD800标记后的BcaCD885细胞未影响其侵袭能力。

表1 各时间点BcaCD885/QD800和BcaCD885细胞的黏附率Tab 1 Adhesion of BcaCD885/QD800 and Bca-CD885 cells at 30,60,90 and 120m in

2.5 QDs对BcaCD885细胞趋化运动的影响

BcaCD885/QD800和BcaCD885侵袭至滤膜下表面的细胞数目分别为79.6±4.1、82.3±3.4，两均数间无显著差异（P＞0.05），表明经QD800标记后的Bca-CD885细胞未影响其趋化运动能力。

3 讨论

近年来基于多学科交叉发展起来的量子点纳米荧光探针，与目前已有的有机物荧光探针（如rhodamine、FITC、Cy3、Cy5等）和各种荧光蛋白探针相比，它具有荧光量子产率高、发光度强、光化学稳定性好、不易被光解或漂白[4-5]，同时QDs的发光特征具有严格的量子尺寸效应,通过改变QDs粒径大小可获得从紫外到近红外范围（或从蓝色到红色波长范围）内任意点的光谱[6]，QDs的这些光学特征是目前所有的荧光探针都不具备的，如果用QDs标记活细胞就可以利用这些光学特征长期观察或同时观察多种活细胞的相互作用及变化情况[1]。

QDs优良的光学特征已在活体非侵入原位研究癌细胞在体内的发生发展、癌症的早期诊断、药物在体内的转运过程等领域显示出了巨大的发展前景[7-8]，特别是近年来发展起来发射波长在近红外光范围内的量子点的荧光不仅对人体组织具有强的穿透力，同时也可避免组织自发荧光的干扰，特别适合行体内非侵入的细胞成像。目前人们利用近红外荧光量子点对体内肿瘤细胞侵袭和转移情况进行成像研究[2，9]证明：QD800不仅具有良好的体内成像能力，而且对细胞没有毒性和不影响其生长。近年来证明用多种具有穿膜作用的肽段表面修饰的QDs能提高对细胞的标记率[10-12]。但还未查见具有穿膜作用的肽段表面修饰的量子点大量标记进入癌细胞后对肿瘤细胞侵袭和转移能力有无影响的研究报道，这是用QDs标记癌细胞后进行非侵入可视化研究得到的结论是否科学以及是否真实地反映了体内癌细胞浸润、转移的情况的首要关键问题之一。

本研究用最大发射波长为800 nm的近红外荧光量子点，由于该量子点表面连接有富含精氨酸聚合体的肽段，因而具有较强的穿膜作用。本研究用肽段连接的QD800与BcaCD885细胞共培养证明：QD800能快速容易进入细胞内对细胞进行标记，标记6 h后对BcaCD885细胞的标记率高达94.07%，大量肽段连接的QD800进入BcaCD885细胞后对细胞的生长、侵袭、黏附和趋化运动能力均无影响。

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（本文编辑 汤亚玲）

Study on effect of peptide-conjugated near-infrared fluorescent quantum dots on invasion and metastasis of human buccal squamous cell carcinoma cell line BcaCD885

MEI Jie,YANG Kai,LI Zhi-gang,CAO Yu-an.（Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China）

ObjectiveTo study the effect of peptide-conjugated near-infrared quantum dots（QDs）on growth, invasion and metastasis of human buccal squamous cell carcinoma cell line（BcaCD885 cell）.Methods1）BcaCD885 cells were labeled by cell-penetrating peptide-conjugated QDs with a maximum emission wavelength of 800 nm（QD800）,then labeling efficiency was detected by flow cytometry,and laser-scanning confocal microscope was used to observe the distribution of QD800 within the cells.2）Different concentrations of QD800 was applied to BcaCD885 cells,and the cell growth of control and three test groups were compared respectively.3）BcaCD885 cells were labeled by QD800（BcaCD885/QD800）,then transwell chambers and wash way were used to dectect the difference of invasion and metastasis ability between BcaCD885/QD800 and BcaCD885 cells.Results 1）The labeling rate of BcaCD885 cells after 6 h was 94.07%,and QD800 distributes in the BcaCD885 cytoplasm.2）Different concentrations of QD800 showed no negative effects on growth of BcaCD885 cells.3）The ability of invasion,attachment and motion of BcaCD885 cells were not significantly different between test and control group（P＞0.05）.ConclusionQDs showed no effects on growth,invasion and metastasis ability of BcaCD885 cells.Our results provide science foundation for QDs as a new fluorescence probes to real-time monitor cells and cells imaging in a living.

quantum dots； near-infrared fluorescence； attachment； invasion

R 739.8

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.022

1000－1182（2011）01－0092-04

2010-09-25；

2010-12-20

国家自然科学基金资助项目（30872925和30470893）

梅杰（1982—），男，重庆人，硕士

杨凯，Tel：023-89012569