特比萘酚对白念珠菌Cahxt5缺失株表型的影响*

王 娟,周二鹏,贾鹏飞

(石家庄学院化工学院,河北石家庄050035)

白念珠菌(Candida albicans)是一种临床常见的条件性致病真菌,正常生理条件下存在于健康畜禽及人的口腔、上呼吸道和肠道等处,很少出现临床致病症状[1]。当菌群失调,免疫机能下降或者发生缺陷时,白念珠菌就会转变成菌丝形态,引发动物或人局部反复感染或者全身性系统感染[2]。在临床上,主要引起禽类上消化道真菌病。白念珠菌的多种生态特征与它能够利用多种糖类作为碳源密切相关[3]。己糖转运蛋白是白念珠菌糖类利用途径中重要的膜蛋白,对于白念珠菌形态转换和毒力侵袭至关重要[4]。本研究应用抗真菌药物特比萘酚对白念珠菌己糖转运蛋白双等位基因缺失株Cahxt5进行表型分析,研究该基因缺失后的表型效应,为指导临床用药和靶向新药开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 野生型白念珠菌菌株SC5314,双缺失株Cahxt5为石家庄学院化工学院实验室构建和保存。

1.1.2 试剂 酵母提取物为北京鼎国昌盛生物技术有限公司原装Oxiod Ltd England产品,批号1116795-02;蛋白胨为北京奥博星生物技术有限公司产品,批号20080408;琼脂粉为北京奥博星生物技术有限公司产品,批号20010802;标准胎牛血清为天津市灏洋生物制品科技有限公司产品,批号TBD31HB;特比萘酚为山东齐鲁制药厂提供,为标准粉剂。二甲基亚砜为德国Merk公司产品。

1.2 方法

1.2.1 测试培养板和液体培养基的制备 按常规方法配制YPD液体培养基(20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物),固体YPD培养基中加入20 g/L的琼脂粉。特比萘酚溶于二甲基亚砜溶液中,母液质量浓度为1 mg/mL,工作液浓度分别为0、25、50、75、100 μ g/mL,分别加入YPD固体培养基中制成相应浓度的特比萘酚平板培养基。

1.2.2 倍比稀释试验 参照文献方法并加以改进[5-6]。在1.5 mL无菌离心管中加入900 μ L无菌水,取对数生长后期细胞培养物100 μ L,加入混匀后,取100 μ L加入第2个含有900 μ L无菌水的离心管中,依次类推,分别将原液做成10—1、10—2、10—3、10—4、10—5和10—6系列浓度,分别取各稀释液2 μ L点接特比萘酚平板,同时以YPD平板做对照。30℃倒置培养。

1.2.3 菌丝诱导形成和特比萘酚抑制试验 将野生型白念珠菌SC5314和CaHXT5缺失株过夜培养至平台期,按照1∶10体积比转接YPD液体培养基中培养至对数生长期后,加入终浓度为100 mL/L的小牛血清,30℃分别诱导0、1、2、4 h后显微镜下观察菌丝形成情况;按上述同样方法,同时加入终浓度为75 μ g/mL的特比萘酚进行镜检观察。

1.2.4 试验图像采集与处理 用Olympus E-3数码相机采集图像,Adobe photoshop CS软件处理。

2 结果

2.1 特比萘酚对CaHXT5缺失株生长的影响

倍比稀释试验前,由于初始细胞均处于平台期饱和状态,故细胞密度相似。将白念珠菌野生型菌株SC5314和缺失株CaHXT5细胞在含有不同浓度的特比萘酚平板上进行点接试验,结果发现,与野生型相比,CaHXT5缺失株细胞在75 μ g/mL的特比萘酚平板上生长缓慢,特比萘酚浓度提到100 μ g/mL时更加明显,相差2个稀释度,表明CaHXT5基因缺失能够增强细胞对特比萘酚的敏感性(图1)。

图1 CaHXT5缺失株在不同浓度特比萘酚平板上的表型分析Fig.1 Phenotype analysis of CaHXT 5 cell on plate with gradient concentration terbinafine

2.2 特比萘酚对CaHXT5基因缺失株菌丝形成的影响

白念珠菌菌丝形成是该菌致病的首要条件,CaHXT5基因缺失后影响白念珠菌的菌丝形成。为进一步研究特比萘酚对白念珠菌缺失株CaHXT5细胞菌丝形成的影响情况,我们通过体外诱导菌丝形成试验来观察特比萘酚存在下缺失株的致病性是否受到了影响。结果显示在没有特比萘酚存在下,CaHXT5细胞菌丝形成比野生型要慢得多;当加入一定浓度的特比萘酚后,与野生型相比,CaHXT5菌株菌丝形成明显受到抑制(图2)。

图2 100 mL/L小牛血清诱导下的特比萘酚影响CaHXT5缺失株的菌丝形成Fig.2 Induced filament formation of CaHXT5 strain by 100 mL/L calf serum under 75 μ g/mL terbinafine

3 讨论

糖类利用途径中的己糖转运蛋白是白念珠菌菌丝形成及致病力的重要因子。丙烯酰胺类药物特比萘酚抑制麦角固醇合成中的角鳖烯环氧化酶催化活性,从而导致麦角固醇合成减少。为有效治疗念珠菌感染,国内外许多学者尝试了特比萘酚和多种唑类药物的联合体外药敏试验[7-11]。虽然这些措施能够缩短疗程,增加抗菌效果,但反复临床应用也能导致更多的耐药菌株出现。通过糖类利用途径来研究特比萘酚对真菌麦角固醇合成的影响还未见任何报道。

CaHXT5是白念珠菌中与毒力有关的葡萄糖高亲和力转运蛋白[12-13],该基因对0.24 mg/L的环比酮胺有较高抗性[14]。鉴于以上试验数据,本试验采用简单、重现性好的倍比稀释方法来分析己糖转运蛋白CaHXT5缺失的白念珠菌细胞对于特比萘酚的敏感表型。从本试验的表型分析结果来看,糖类利用途径缺陷导致细胞糖类吸收出现障碍,使特比萘酚对角鳖烯环氧化酶的催化活性快速失活,这为通过己糖转运蛋白为靶标筛选新的抗真菌药物或者依据特比萘酚母环来设计新型衍生物候选药提供了极为有价值的理论参考。

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