采用唾液淀粉酶和D-木糖排泄率对利血平脾虚证模型的评价研究*

李 灿，张海艇，陈玉龙

中医动物模型是开展中医证候及中药新药实验研究的重要方法之一，已成为中医科研方法体系的一个重要组成部分，但是如何对所建立的动物模型进行评价，是中医证候模型研究的难点。

本研究应用此指标对最常用的中医动物模型利血平脾虚证模型进行了评价，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

SD雄性大鼠44只，体重100g～140g，广东省实验动物中心提供(合格证号SCXK(粤)2008-0002)，适应性饲养至平均体重300g左右时开始实验。

1.2 试剂

利血平注射液为广东邦民制药厂有限公司出品(批号080813)，生理盐水为太极集团西南药业股份有限公司(批号08080017)，冰乙酸广州市番禺力强化工厂(批号20070803-3)，可溶性淀粉、碘化钾为天津大茂化学试剂厂，Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4、碘酸钾、生理盐水为广州化学试剂厂，苯甲酸为广州星群制药厂，以上试剂均为分析纯。

1.3 仪器

H-600E-M型透射电镜(日本 HITACHI公司);DY89-1型电动匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Uvmini-1240紫外分光光度计(岛津制作所);DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

1.4 分组和造模

雄性SD大鼠自由饲养至300g左右，随机分为正常组20只、模型组大鼠24只，模型组大鼠皮下注射0.5mg/kg/d利血平注射液8d;正常组大鼠注射等量生理盐水8d。第9天正常组随机处死10只大鼠，模型组大鼠12只，其余大鼠正常饲养30d。

1.5 标本取材

唾液取材方法:用2%戊巴比妥钠以3ml/kg剂量麻醉后，待其稍清醒处于嗜睡状态容易控制时，用带塑料套管的注射针头在大鼠口腔内部两侧抽取唾液10min，等大鼠稍清醒时用10%冰乙酸溶液20μl刺激大鼠舌尖1次/min，共刺激30min，在刺激的过程中同时抽取唾液10min，分别标记冷冻保存。

第9天和第39天，处死前用2%戊巴比妥钠以3ml/kg剂量麻醉，麻醉后用剪刀沿左侧耳后剪开一条线取下左侧腮腺，一部分用3%戊二醛固定做电镜检查，剩余部分冷冻保存;缝合伤口，等大鼠稍清醒时用10%冰乙酸溶液20μl刺激大鼠舌尖1次/min，共刺激30min，取下右侧腮腺，一部分用3%戊二醛固定做电镜检查，剩余部分冷冻保存。冷冻保存部分用以检测其他指标。

1.6 检测指标

1.6.1 一般状态 每日观察记录各组大鼠的体重、摄食量、精神状态、活动情况、大便性状和毛发光泽度。

1.6.2 唾液淀粉酶的活性和唾液流量检测唾液淀粉酶活性检测采用碘比色法［3］，具体方法如下:各玻璃管加入0.04%可溶性淀粉溶液1ml，37℃恒温水浴3min，空白管加入0.01ml水，样品管加入唾液10μl混匀，37℃ 水浴 7.5min，全部管中加入1ml碘应用液，在波长660nm处用分光光度计测各管的OD值。

淀粉酶活性的计算方法:淀粉酶单位/100ml=(对照管 OD值-测定管的 OD值)/对照管 OD值 ×1600;酸刺激前后唾液淀粉酶活性(sAA)活性比值=酸刺激后sAA活性单位/酸刺激前sAA活性单位;刺激前流量比=刺激后流量/刺激前流量;刺激前后总sAA活性比值=(酸刺激后sAA活性单位×刺激后流量)/(酸刺激前sAA活性单位×刺激前流量)。

1.6.3 腮腺淀粉酶检测 用4℃预冷的匀浆器在预冷的PBS缓冲液中按5ml/g组织的量匀浆腮腺组织;在4℃ 14000×g离心5min，取上清。检测方法如上。

1.6.4 检测尿D-木糖排泄率 造模结束后所有大鼠禁食不禁水12h后，每只大鼠灌胃3%D-木糖4ml，收集5h尿液。参考文献［4-5］用对溴苯胺法测定尿 D-木糖排泄率:每例取0.5ml尿液样本，双蒸水稀释10倍后加入2%对溴苯胺溶液2.5ml，取浓度为1mg/ml的 D-木糖溶液，依次倍比稀释制作标准曲线，样本管和标准管置70℃恒温水浴箱10min，然后室温放置70min，以分光光度计在波长520nm下检测。

木糖排泄率(%)=［(根据标准曲线所计算浓度(mg/mL)×尿总量 mL×尿液稀释倍数/灌胃木糖量)］ ×100% 。

1.6.5 大鼠腮腺组织病理学检查 大鼠麻醉后用剪刀沿左侧耳后剪开一条线，取下左侧腮腺，4℃生理盐水清洗后置中性甲醛溶液固定。固定12h后，经梯度酒精脱水、二甲苯固定后石蜡包埋，切片HE染色做病理组织学观察。

1.6.6 电镜下观察酶原颗粒数量 固定、包埋，在解剖显微镜下修块，切半薄切片，HE染色。在解剖显微镜下和普通显微镜下定位，超薄切片，电子染色、漂洗，干燥后电镜下放大100000倍观察。

1.7 统计学处理

实验数据用SPSS11.0统计软件进行处理，计量资料2组比较用t检验，实验数据以珋x±s表示。

2 结果

2.1 利血平脾虚模型动物观察

大鼠一般状态:大鼠注射利血平造模后，扎堆懒动，烂便，毛色粗糙，食量减少，体重下降(与正常组比较:P＜0.01);造模第8天停药后，造模大鼠食量增加，体重逐渐回升，第39天正常组与实验组无差别(见图1)。

图1 2组动物体重变化

2.2 尿D-木糖排泄率

表1显示，在造模前、第9天(造模结束)、第23天、第39天4次检测各组大鼠尿D-木糖排泄率。在造模前模型组、正常大鼠木糖排泄率无差异(与正常组比较P＞0.05);第9天模型组与正常组大鼠木糖排泄率明显降低(与正常组比较P＜0.01);在第23天模型组与正常组大鼠木糖排泄率仍降低(与正常组比较P＜0.05);第39天模型组木糖排泄率逐渐回升，但仍低于正常组(与正常组比较P＜0.05)。

表1 尿D-木糖排泄率(珋x±s，%)

2.3 唾液流量及唾液淀粉酶

2.3.1 酸刺激前后2组大鼠的唾液流量 表2显示，造模第9天和第39天，2组大鼠在酸刺激后唾液流量与刺激前相比均显著升高，但2组大鼠间无显著差异。

表2 正常组和模型组大鼠酸刺激前后唾液流量比较((μl)珋x±s)

2.3.2 酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值变化每组10只大鼠，比较实验第9、23、39天的酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值，发现实验组在第9天酸刺激前后唾液淀粉酶活性显著降低，第39天2组无显著意义。

表3 酸刺激前后酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值

2.3.3 大鼠腮腺内淀粉酶活性 第9天，2组大鼠腮腺内sAA在酸刺激前没有显著差异，但是模型组大鼠在酸刺激后sAA高于正常组，刺激后的下降率低于正常组。第39天，给予模型组大鼠酸刺激后腮腺sAA仍高于正常组大鼠。

表4 2组大鼠腮腺内淀粉酶活性(活性单位/g组织)(珋x±s)

2.4 各组大鼠腮腺组织形态学观察

第9天和39天，各组大鼠腮腺组织病理学检查均未发现各组大鼠腮腺组织有明显病理改变，镜下所见腺体细胞无肿大，间质未见充血水肿，腺管周围及纤维间质中无淋巴细胞和浆细胞浸润，腺泡未见萎缩、消失，腺管上皮未见增生水肿，管腔内未见充满坏死细胞和渗出物(见图2)。

2.5 酸刺激下腮腺酶原颗粒

第9天显示，2组大鼠腮腺组织内酶原颗粒在酸刺激前没有显著差异，在刺激后正常组显著下降，模型组残留的酶原颗粒数量显著高于正常组(详见图3)。

第39天，观察酸刺激后各组大鼠腮腺内残余的酶原颗粒，模型组相对正常组残余的酶原颗粒数量较多(见图4)。

3 讨论

用利血平法建立脾虚证动物模型由北京市中医研究所首创［6］，是目前中医药研究最常用的动物模型之一。一般情况下，动物模型有自然恢复现象，利血平脾虚证动物模型也不例外。我们的实验表明，利血平脾虚大鼠模型在造模刚结束时动物出现饮食减少、体重下降、便溏、消瘦、懒动、两眼眯缝等类似脾虚证的表现，这些症状比较符合脾虚证候，但是在停用利血平后，各种症状特别是体重有所恢复，虽然仍有所偏低，但从单一症状上已很难说明动物还是脾虚证候。

图2 光镜下观察各组大鼠腮腺组织的形态学改变(HE染色 ×400)

图3 第9天正常组和模型组大鼠腮腺组在透射电镜观测腮腺组织酶原颗粒(×105)

图4 第39天大鼠腮腺组织在透射电镜观测腮腺组织酶原颗粒(×105)

脾气虚证是以消化系统为中心的多系统、多器官功能障碍综合症候群，以消化、运动、吸收功能障碍为主。木糖是一种五碳糖，通常在血液中不存在，主要在小肠上段吸收，所以D-木糖排泄率能够反映空肠的吸收功能状态。中医认为，脾与唾液分泌关系密切，是重要的消化腺。研究发现，脾虚患者在酸刺激下唾液淀粉酶活性(sAA)比值下降。1986年在郑州召开的全国虚证研究会议和中药新药临床研究指导原则确定，木糖吸收试验和酸刺激下sAA为脾虚证诊断的参考指标，目前这2项指标己被广泛应用于脾虚证的研究中。因此，课题组采用反映小肠吸收功能的D-木糖排泄率和反映消化酶分泌的唾液淀粉酶为主要评价模型的指标。

本研究表明，模型组动物在造模结束时D-木糖排泄率显著下降，并一直持续到模型后30d，说明利血平法脾虚模型在小肠吸收方面从造模结束一直到模型后30d仍存在功能障碍。造模结束后，酸刺激前后的唾液分泌流量没有差异，而唾液淀粉酶活性比值较正常大鼠相比显著降低，滞留腮腺的唾液淀粉酶酸前后比值增高，说明脾虚模型大鼠存在唾液淀粉酶分泌障碍，这与临床观察相一致。在造模后30d，唾液淀粉酶分泌障碍有所恢复，但仍然存在。

在本研究中，我们用直接抽取和唾液腺匀浆2种方法测定检测酸刺激前后唾液淀粉酶分泌情况，发现唾液腺匀浆方法得到的数据更为稳定。

为进一步研究唾液淀粉酶分泌障碍机制，我们对利血平脾虚证模型腮腺进行普通病理和电镜观察，发现在普通病理上没有变化。电镜超微结构可知，脾虚证模型酶原颗粒较多，特别是在酸刺激下，模型组残留的酶原颗粒数量显著高于正常组。表明动物唾液淀粉酶分泌障碍不是由于炎症或者纤维化等所引起，但其机制有待于进一步研究。

总之，本实验应用D-木糖排泄率和酸刺激前后唾液淀粉酶分泌比值对利血平脾虚模型大鼠进行了评价，发现该模型符合脾虚证诊断标准，并且可以在一段时间内(造模后1d～30d)用来评价药物疗效。D-木糖排泄率比酸刺激前后唾液淀粉酶分泌比值更灵敏和方便。

［1］ 1986年全国中两医结合虚证与老年病研究专业委员会.中医虚证辨证参考标准［S］.中西医结合杂志，1986，6(10):598.

［2］ 中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则［S］.北京:人民卫生出版社，1993:93-95.

［3］ 李仪奎.中药药理实验方法学［M］.第2版.上海:上海科学技术出版社，2006:239-245.

［4］ 张 翥，马继伟，李寅超.溢尿停对实验性脾虚SD大鼠胃肠功能的影响［J］.辽宁中医杂，2004，31(8):703-704.

［5］ 张爱郁，白德贞，张延英，等.慢性腹泻161例尿 D-木糖测定的临床研究［J］.甘肃中医学院学报，1993，10(4):13-14.

［6］ 北京市中医研究所.有关脾气虚实质的临床观察和实验研究［J］. 中华医学杂志，1982，62(1):22.