吡啶丙烯酸衍生物的合成及放射增敏作用的研究*

李 宁 周晓靓 施培基 王 浩 王荣先

放疗增敏剂是目前肿瘤治疗研究领域较热门的一类药物，一些增敏效果较好的药物如硝基咪唑类由于具有神经毒性而限制了其临床应用[1]。烟酰胺是近年来研究较多的放射增敏剂，与Carbogen气体（95%O2+5%CO2）合用增敏效果更好，且毒性低[2-4]。Qin等[5]以烟酰胺为母体化合物通过结构改造，合成了比母体化合物增敏作用更好、毒性更低的一系列化合物。但由于烟酰胺吡啶环的空间位阻作用，使这类烟酰氨基酸衍生物的合成较困难并且收率较低。本研究通过结构改造，在这类化合物基础上利用电子等排原理设计合成出了新型吡啶丙烯酸衍生物，即N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸，并应用噻唑蓝比色法（MTT实验）及集落形成实验观察该化合物对体外HeLa细胞的增敏作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 3-吡啶丙烯酸（sigma公司）；2-氨基丁酸乙酯盐酸盐（中国医学科学院放射医学研究所药物室合成）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、1-羟基苯并三唑（HOBt）购自上海共价化学科技有限公司；磁共振氢谱用Varian Mercury Vx-300磁共振仪测定，TMS为内标；熔点用BUCHI 535测定（熔点未校正）；HeLa细胞由中国医学科学院基础医学研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 化合物制备 锥形瓶中依次加入447 mg（0.003 mol）3-吡啶丙烯酸，671 mg（0.004 mol）2-氨基丁酸乙酯盐酸盐，800 mg（0.004 mol）EDC·HCl，540 mg（0.004 mol）HOBt，30 mL二氯甲烷，稍微摇匀后加入干燥重蒸后的三乙胺1.2 mL，室温电磁搅拌5 h后过滤，依次用蒸馏水（12 mL×1次）、碳酸氢钠饱和溶液（12 mL×3次）、蒸馏水（12 mL×3次）洗涤二氯甲烷反应液，再用无水硫酸钠干燥过夜。蒸除二氯甲烷，得到黄白色粉末，用乙酸乙酯-环己烷重结晶。将所得固体与3 mL 2.5%氢氧化钠水溶液完全反应，用浓盐酸调pH至4～5，析出白色沉淀，过滤干燥后即得产品。

1.2.2 细胞培养 设有氧培养组和乏氧培养组。HeLa细胞培养于37℃，5%CO2含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，乏氧培养组于照射前30 min置于充有氮气的密闭容器中培养。

1.2.3 MTT实验 取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化计数将2×107/L细胞接种于96孔板，每孔200 μL，贴壁培养12 h后，分别加1、2、4、8、16、32 mmol/L浓度的药液，每种浓度设平行3孔，设不加药的培养基（含血清）为空白对照。加药培养12 h及24 h后每孔加入25 μL（5 g/L）MTT，继续培养4 h。乏氧培养组在每个培养周期最后30 min置于氮气中培养。吸出培养液加入150 μL的DMSO，振摇5 min，用酶标仪于492 nm波长测吸光度，计算细胞抑制率=1-（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。

1.2.4 集落形成实验 根据不同照射剂量接种不同细胞数于6孔板，每个剂量组分别设有氧单纯照射组、有氧照射+给药组、乏氧单纯照射组及乏氧照射+给药组，每种剂量设平行3孔。给药组培养12 h后加入药液，孵育24 h后（乏氧组于照射前在氮气中培养30 min）按不同剂量照射。照射采用137Cs（Gammacell 40，加拿大产）γ射线进行照射，剂量率0.807 Gy/ min，设计照射剂量为0、1、2、3、4、6、8 Gy。照射后1 h更换培养液，继续培养6 d。吸出培养液，加甲醇固定3 min，0.1%结晶紫染色2 min，显微镜下计数克隆形成数（含有≥50个细胞的集落），取平行3孔的平均数计算集落形成率。利用软件sigmaplot 10，采用多靶单击模型S=1-(1-e-D/D0)N,在半对数坐标上以照射剂量为横坐标，细胞生存分数的对数值为纵坐标，拟合细胞存活曲线，并根据Dq=D0/lnN计算该化合物的放射增敏参数，得出放射增敏比（SER）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，实验数据以±s表示，组间比较采用成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化合物合成结果 N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸为白色粉末，总收率78%，纯度99.2%，熔点为225℃～226℃（分解），结构式见图1。1H-NMR（DMSO）：δ=0.916（t,3H,-CH3）,1.743（m, 2H,-CH2-）,4.270（m,1H,-NH-）,6.852（d,1H,-HC=C（α）H-）,7.463（d,1H,-H（β）C=CH-）,7.967（d,1H,5-H pyr）,8.406（d,1H,4-H pyr）,8.540（s,1H,6-H pyr）, 8.744（s,1H,2-H pyr）,12.647（s,1H,-COOH）。MS： C12H14N2O3,M+=234.1(计算值为234.1)。

2.2 MTT实验结果 加药培养12 h组的细胞抑制率无明显规律，24 h组结果显示N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸作用于HeLa细胞抑制率随药物浓度的增加而增强，相关数据见表1、2。各药物浓度抑制率24 h组与12 h组相比差异均有统计学意义（均P＜0.01）。根据24 h组结果得到该化合物有氧条件下对Hela细胞的50%细胞死亡所需药物浓度（IC50）和20%细胞死亡所需药物浓度（IC20）分别为12.30和1.66 mmol/L，乏氧条件下分别为8.37和1.32 mmol/L。采用化合物的IC20作为放射增敏实验的药物浓度。

表1 有氧条件下不同药物浓度的细胞抑制率（n=3,%±s）

表1 有氧条件下不同药物浓度的细胞抑制率（n=3,%±s）

＊＊P＜0.01

药物浓度（mmol/L） 12 h 24 h t -33.949＊＊77.623＊＊44.837＊＊54.347＊＊24.174＊＊57.681＊＊012481 6 32 0.00 2.22±0.11 13.48±0.14 15.16±0.89 10.42±0.55 24.20±1.09 19.71±0.96 0.00 8.32±0.29 29.64±0.33 47.49±0.87 32.00±0.41 56.49±2.04 80.52±1.55

表2 乏氧条件下不同药物浓度的细胞抑制率（n=3,%，±s）

表2 乏氧条件下不同药物浓度的细胞抑制率（n=3,%，±s）

＊＊P＜0.01

药物浓度（mmol/L） 12 h 24 h t -45.262＊＊37.985＊＊32.614＊＊36.161＊＊55.130＊＊50.833＊＊012481 6 32 0.00 1.03±0.24 3.17±0.09 12.53±0.41 20.70±0.86 28.19±1.03 23.03±1.09 0.00 11.32±0.31 37.50±1.56 49.61±1.93 52.61±1.27 67.17±0.66 83.25±1.74

2.3 HeLa细胞的放射增敏实验结果 照射后HeLa细胞集落形成能力随照射剂量的增加而下降，且在同一照射剂量，照射+给药组集落形成率明显低于单纯照射组，乏氧培养组集落形成率明显低于相应有氧培养组,见图2。根据“多靶单击模型”计算出N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸对HeLa细胞的有氧放射增敏比为1.44，乏氧放射增敏比为1.84。说明该化合物可增加HeLa细胞的放射敏感性，多靶单击模型主要参数见表3。

图2 照射存活曲线

表3 多靶单击模型主要参数

3 讨论

本研究采用MTT实验测定N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸对HeLa细胞的毒性，文献报道烟酰氨基酸衍生物IC50为10 mmol/L[5]，因此本实验以该浓度为依据设计不同浓度（1、2、4、8、16、32 mmol/L）进行MTT实验。实验中测定加药培养12 h和24 h后细胞存活率，以测定药物对HeLa细胞的毒性作用，结果显示加药孵育24 h后作用较明显，故采用该时间为照射前细胞培养的最佳时间，N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸在体外实验中对HeLa细胞的毒性作用较小，有氧培养组和乏氧培养组IC50分别为12.30 mmol/L和8.37 mmol/L。为了降低药物的细胞毒性对实验的影响，通常采用药物的IC20作为给药剂量进行照射实验,因此增敏实验采用药物浓度为有氧组1.66 mmol/L，乏氧组1.32 mmol/L。

本研究显示有氧培养和乏氧培养组中，照射+给药组Dq、D0值均小于单纯照射组，可知该化合物对有氧和乏氧的HeLa细胞均有增敏作用。照射增敏实验中，乏氧培养组所用药物浓度小于有氧培养组，但其放射增敏比（1.84）明显高于有氧培养组（1.44），表明其对乏氧细胞有较好的增敏作用。

烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，广泛分布于体内，导致烟酰胺作为放疗增敏剂使用时肿瘤靶向性较差[6]。有研究表明烟酰胺侧链引入氨基酸得到烟酰胺基酸衍生物可加强其放射增敏作用，可能的机制为药物通过氨基酸转运途径到达肿瘤组织，增加了其肿瘤靶向性[7]，但此类化合物的合成过程中需利用叠氮法，毒性较大，合成方法复杂[5]。本实验合成的N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸是全新化合物，设计原理是在烟酰胺基酸衍生物基础上引入一个双键侧链,增加了其侧链长度，从而大大降低了引入氨基酸时吡啶环的空间位阻作用。与文献报道的通过叠氮法合成烟酰胺基酸衍生物相比[5]，本实验未使用活泼试剂，仅在室温下通过缩合反应和水解反应即可得到产物，反应条件温和，降低了合成难度，产率较高（78%），与文献报道的生物结果相当[5],且简化了合成方法，有较好的应用前景。

本研究合成了N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸，并初步评价了其细胞毒性及其放射增敏作用，证明该化合物对体外HeLa细胞有放射增敏作用，但其增敏机制还有待进一步深入研究。

[1]Bischoff P,Altmeyer A,Dumont F.Radiosensitising agents for the radiotherapy of cancer:advances in traditional and hypoxia targeted radiosensitisers[J].Expert Opin Ther Patents,2009,19(5):643-662.

[2]张英男，顾为望，李体远，等.烟酰胺和Carbogen增敏89Sr治疗对小鼠骨髓毒性作用影响[J].核技术，2004，27（4）：289-292.

[3]van Laarhoven HW,Bussink J,Lok J,et al.Modulation of hypoxia in murine liver metastases of colon carcinoma by nicotinamide and carbogen[J].Radiat Res,2005,164(3):245-249.

[4]Rijpkema M,Kaanders JH,Joosten FB,et al.Effects of breathing a hyperoxic hypercapnic gas mixture on blood oxygenation and vascu⁃larity of head-and-neck tumors as measured by magnetic reso⁃nance imaging[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2002,53(5): 1185-1191.

[5]Qin ZZ,Zhang FB,Jiang TN,et al.Synthesis and Evaluation of Nic⁃otinoylamino acid compounds as radiosensitizer[J].Chem Res Chi⁃nese Universities,2008,24(4):496-500.

[6]Horsman MR,Chaplin DJ,Brown JM.Radiosensitization by nicotin⁃amide in vivo:a greater enhancement of tumor damage compared to that of normal tissues[J].Radiation Res,1987,109(3):479-489.

[7]刘晓秋，王荣先，李美佳，等.放射增效剂9402号对小鼠小肠隐窝上皮细胞增敏作用的研究[J].中国辐射卫生，2007，3（16）：10-11.