止凝血研究在脓毒症中的进展

任 静 门剑龙

在脓毒症所致的多器官功能障碍的病理发展过程中，外周微循环的干扰，白细胞和活化补体对组织和细胞的损害，使患者内皮细胞、血小板和凝血系统功能紊乱，从而导致弥漫性血管内凝血（DIC）的发生。研究表明，止凝血系统的功能紊乱与患者预后密切相关，尽管有关脓毒症的相关抗凝血治疗研究获得进展，但除了活化蛋白C替代疗法外，近期几乎所有的关于脓毒症抗凝、抗炎的临床试验均未成功[1]。脓毒症仍伴随很高的病死率。对于脓毒症的研究目前已经逐步拓展到对于DIC的早期诊断、预后评估以及血管内皮损伤等领域，现就相关脓毒症止凝血研究现状综述如下。

1 脓毒症DIC与创伤DIC

目前，国际上许多机构，包括日本厚生劳动省、国际血栓与止血协会（ISTH）和日本急诊医学协会（JAAM）都提出了关于DIC的诊断标准。这些标准中均采用凝血酶原时间、血小板计数、纤维蛋白原、纤维蛋白（原）降解产物或D-二聚体等指标用于止血异常监测。其中JAAM的DIC诊断标准的敏感性在几套标准中是最高的，但特异性尚不清楚[1]。严重脓毒症的病死率约为35%～45%，其中合并DIC的患者的病死率高于未合并DIC的患者，表明脓毒症患者的DIC发生频率很高且预后不良[2]。所以早期诊断和治疗DIC，对最终预防脓毒症DIC所致死亡是必要的。创伤患者（特别是头部外伤）存在凝血紊乱，可导致DIC的频繁发生，其程度与脓毒症类似，但脓毒症患者的28 d病死率显著高于创伤患者[3]。另一项关于头部外伤患者的前瞻性研究显示，合并DIC患者比未合并DIC患者的预后更差，与创伤患者比较，脓毒症患者表现为血小板更低，凝血酶原时间比率更高，以及更高的组织衰竭积分，而第3天创伤患者的DIC缓解的比例显著高于脓毒症患者[3]。超过50%的根据JAAM标准诊断的脓毒症合并DIC患者在28 d内死亡，而这些患者在最初的3 d是无法利用ISTH的DIC标准进行鉴别的。提示ISTH关于DIC的诊断标准对诊断脓毒症患者早期DIC敏感性不足[1]。

有研究者认为合并DIC的创伤与合并DIC的脓毒症具有相同的病理生理过程，但创伤的DIC发生机制可能不同于脓毒症的DIC[4]。ISTH下属的科学标准委员会的DIC分会对脓毒症并发DIC进行定义时，强调血管内皮细胞损伤和炎症反应[5]。而创伤后的DIC，则是脑组织、脂肪、羊水或其他强促凝物质进入血液循环，造成DIC急性发作；当血管内皮细胞进一步炎症损伤或功能障碍，清除活化凝血因子的能力减弱，使微血栓形成并造成二次损伤和DIC加重，从而引发了亚急性DIC[6]。两者机制上的差异是明显的。Kushimoto等[3]研究认为，在创伤患者和脓毒症患者间，凝血功能异常、器官功能紊乱和DIC预后存在显著的差异。

2 血小板在脓毒症所致的内皮细胞损伤过程中的作用

血小板除具有止血功能外，还是病原微生物侵入时调节免疫反应的重要介质。脓毒症时循环中的血小板能够与脂多糖结合，经由Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）介导，结合中性粒细胞，并诱导白细胞外杀菌途径（neutrophil extracellular traps，NETs）的形成。TLRs主要参与机体感染防御，但在全身感染时也参与损伤性的微血管功能紊乱和器官衰竭。随后产生肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的合成，最终导致内皮细胞损伤和血管炎[7]。在脓毒症时，细菌性产物可显著改变血小板在网状内皮系统噬菌过程中的作用，并且还影响血小板的快速清除和早期的炎症过程[8]，但直至目前为止，尚没有足够的研究证明，细菌性产物可以引起血小板自身对血管内皮细胞的直接影响。

Kuckleburg等[9]通过观察负载细菌的血小板与内皮细胞间的相互作用发现通过生成ROS可激活半胱天冬酶（Cas⁃pase）8和Caspase9以诱导凋亡，而FasL/Fas间的交互作用似乎是独立的，研究认为抑制血小板与内皮细胞相互间的作用可减轻内皮细胞的损伤并改善脓毒症患者的病情。这种关于血小板经由ROS生成诱导凋亡的新机制同样不能体现出与TNF-α之间的关联。Semple等[10]认为血小板CD40L-内皮细胞CD40间的交互作用对介导内皮细胞死亡可能是重要的（可能是通过FasL/Fas旁路的交互作用实现的）。正常情况下，CD40-CD40L在内皮细胞、T细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞上表达，由于血小板-内皮细胞黏附过程是通过CD40-CD40L诱导促炎性介质和组织因子的释放以及黏附因子表达实现的，因此CD40-CD40L在血管损伤时大量表达于内皮细胞[11]。越来越多的证据支持脓毒症时血小板在细菌介导的炎症反应中产生关键作用，且血小板自身能够直接诱导内皮细胞死亡[12]。这种新的血小板依赖机制显示，血小板通过诱导内皮细胞的凋亡和暴露内皮下细胞外基质，直接导致了血管炎症和血栓形成。关于脓毒症时血小板-细菌-内皮细胞之间相互作用的研究可提高对血小板如何介导血管并发症的认识。

3 双相（BPW）活化部分凝血活酶时间（APTT）测定对脓毒症的诊断

Downey等[13]于1997年在对DIC患者进行APTT检测时，发现在血浆凝固过程中存在异常的透射波形，在血浆凝固前先出现假性凝固曲线，即BPW，该试验称为“双相APTT”。随后的研究证明BPW与血管内凝血无关，其发生原因是钙离子依赖的C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，vLDL）复合物形成所致的透光度改变[14]。CRP可能以某种方式参与脂蛋白代谢，而感染时产生某些因素（如内毒素）可诱导肝脏vLDL分泌增加，内毒素对vLDL的结构有直接的影响，可改善心脏的能量利用。目前，已有大量研究表明，BPW可作为一种全身炎症反应综合征的指示性指标，可用于脓毒症和早期DIC的诊断。Cho⁃pin等[15]研究显示，BPW诊断严重脓毒症的敏感性为90%，对脓毒性休克的阴性预期值为92%，其鉴别上述2种疾病的准确性优于CRP和降钙素原（procalcitonin，PCT）；与死于其他疾病的患者相比，BPW在最初1～3 d中更多地出现于死于脓毒症的患者，BPW在对与脓毒症相关的3 d病死率的预后评价中表现出极佳的特异性（91%）和阴性预期值（98%）。近期的一项研究显示，双相APTT对重症监护病房（ICU）的脓毒症患者的诊断敏感性为81%，特异性为76%，联合双相APTT和PCT检测不能增加诊断敏感性，但可增加诊断特异性达94%，在ICU的全身炎症反应综合征患者组中，双相APTT可识别出病死率增加的一组，出现BPW的患者组的病死率高于未出现BPW的患者组，双相APTT的应用不仅局限于ICU患者，非ICU患者的BPW与阳性血培养结果相关[16]。Hussain等[17]研究显示，双相APTT能够在特定高风险的患者中识别脓毒症患者。Matsumoto等[18]发现尽管双相APTT诊断DIC的特异性为95.4%，但敏感性仅为59.2%。因此，BPW可能仅仅作为各类感染的标志，而BPW与DIC高风险的一致性可能仅见于严重的脓毒症患者中[16]。BPW现象的潜在机制与凝血活化导致的DIC有关，特别是vLDL微粒中包含着负电荷的磷脂，这是与凝血因子形成复合物的基础。这些磷脂使vLDL微粒具有促凝作用，同时也可在血小板活化过程中转移至血小板[19]。尽管生理水平的vLDL促凝效果已经被发现，但vLDL微粒在高浓度时是否与促凝有关尚待研究。双相APTT已经显示出其对DIC患者不良预后的预警价值。

4 烧伤与脓毒症

尽管烧伤后存活率已经上升，但病死率依然很高。凝血紊乱已经被证明是增加烧伤后发病率和病死率的危险因素，但其确切的病理机制尚未完全阐明。在凝血病理过程的早期阶段，纤维蛋白（原）水平显著增高，提示患者存在高凝状态，由于烧伤后早期阶段的消耗，抗凝血系统的相关蛋白（抗凝血酶、蛋白C等）明显下降，而补充液体治疗导致的稀释也可能是降低的原因，此外由于抗凝血酶（antithrombin，AT）的减少，导致凝血因子的活性增加[20]。在烧伤后的早期阶段，AT活性的降低可由多种机制诱导并会造成多种不良的结果，其中脓毒症的作用是显著的。在烧伤时诊断脓毒症是较为困难的。Barati等[21]研究显示，脓毒症患者的PCT显著增高，CRP、白细胞计数（WBC）、中性粒细胞和红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）则未发生显著改变。死亡患者的血浆PCT显著高于存活的患者，PCT水平对于诊断烧伤后合并的严重感染以及评估不良预后是有效的，其他参数应用价值则较低[22]。

动物实验结果显示，补充AT不仅有抗凝的功能，而且具有免疫调节的效果，可以削弱T细胞反应和炎症过程，此外补充AT对烧伤后肺部的指标存在明显有益的影响,该动物模型中再现了AT补充治疗，同时应用肝素无法实现同样的效果,此研究重复性地提示了烧伤后早期阶段的低水平AT现象和应用AT的临床优势，抗凝治疗对于减轻烧伤和烟吸入性损害是有效的[23]。Lavrentieva等[24]研究显示，在烧伤后早期阶段应用AT补充治疗可以降低发病率和病死率。DIC的高发病率和病死率是重症烧伤患者常见的现象，其间的关联是明显的。但目前所有研究中存在的不足是没有达到必须的观察例数，从而影响了结论的说服力。但在烧伤后的早期阶段进行AT治疗，可能改变患者凝血系统的功能状态，并且减轻了器官衰竭的程度以及降低病死率。

5 新生儿脓毒症的实验室监测

在发展中国家，每年会有大约160万新生儿死于感染，其中多数是脓毒症和脑膜炎[25]。Walliullah等[26]发现微量红细胞沉降率以及未成熟粒细胞与白细胞数量之间的比率(imma⁃ture and total neutrophil ratio，I/T)对早期诊断新生儿败血症有意义。另一些研究采用白细胞计数、CRP、白细胞介素-6（in⁃terleukin-6，IL-6）、TNF-α等指标对新生儿脓毒症晚期进行独立或联合评价，结果显示，脓毒症组和疑似脓毒症组患者的CRP和IL-6水平显著增高，TNF-α水平仅在脓毒症组中显示出异常，IL-6、TNF-α与CRP的诊断符合率相近，均优于白细胞计数，并与患者病情及预后相关，多参数的联合评价并不能增加诊断的有效性[27]。由于在健康的生理条件下，IL-6低水平表达，当机体发生感染、创伤或其他应激状态时，内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞会在病毒或细菌内毒素的诱导下迅速显著表达IL-6，同时大量释放的还包括TNF-α等细胞因子。因此，IL-6和TNF-α水平变化能够有助于对脓毒症的诊断，并可监测脓毒症时内皮细胞的损伤或功能异常。当CRP和白细胞计数连续进行监测时，其联合评价可增高诊断的准确性。

随着对脓毒症患者止凝血各系统功能的深入研究，将有新的指标被应用与评估，更多的指标间联合评价方法将会出现，使临床和实验室对于患者发生DIC的早期预警和对预后评价能力逐渐增强，儿童和新生儿的脓毒症早期预警也开始引起研究者更多的注意。此外，对于血管内皮、血小板和凝血系统的基础研究会进一步成为重点，血管内皮细胞的损伤可能会成为许多研究的核心内容，其中血小板与内皮损伤之间的机制最有可能出现突破性进展。近期的研究表明，局部和全身性感染的免疫应答依赖于细胞内外的模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs），在此过程中，内皮细胞TLRs的角色已经明确[28]，而血管内皮细胞NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）同样参与了感染时的免疫防御应答[29]。从长远看，对于细胞内外PRRs和下游信号分子作用机制的干预研究将可能促进新的治疗策略的出现，并为将来对DIC和多器官衰竭的防治提供理论依据。

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