银杏叶提取物EGB761对阿尔茨海默病家兔模型ACAT1和 LCATmRNA表达的影响*

姜希娟，卢 斌，马东明，郭茂娟，杨 琳，张瑞峰，王 强，范英昌

（1.天津中医药大学病理教研室，天津 300193；2.天津中医药大学实验教学部，天津 300193）

银杏叶提取物EGB761对阿尔茨海默病家兔模型ACAT1和 LCATmRNA表达的影响*

姜希娟1，卢 斌2，马东明2，郭茂娟2，杨 琳2，张瑞峰1，王 强1，范英昌1

（1.天津中医药大学病理教研室，天津 300193；2.天津中医药大学实验教学部，天津 300193）

[目的]观察银杏叶提取物EGB761对阿尔茨海默（AD）病家兔模型胆固醇酰基转移酶（ACAT1）和卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）mRNA表达的影响。[方法]以2%高胆固醇饲料喂养雄性新西兰大白兔，建立AD家兔模型。模型建立后，用50 mg/（kg·d）EGB761灌胃3周作为EGB761组，以5 mg/（kg·d）辛伐他汀作为阳性药对照组。干预结束后,通过实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测海马卵磷脂-胆固醇酰基转移酶mRNA和胆固醇酰基转移酶1 mRNA的表达。[结果]银杏叶提取物EGB761可以下调ACAT1 mRNA的表达，不影响LCAT mRNA的表达。[结论]银杏叶提取物EGB761可下调AD家兔模型ACAT1 mRNA表达，对LCAT mRNA表达无调节作用。

银杏叶提取物EGB761；阿尔茨海默病；卵磷脂-胆固醇酰基转移酶；胆固醇酰基转移酶1

近年来，高胆固醇血症的发病率呈现不断上升态势，有研究显示外周胆固醇升高可影响脑胆固醇酯化关键酶卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）和胆固醇酰基转移酶（ACAT1）的表达，进而影响游离胆固醇和胆固醇酯的平衡。细胞内胆固醇酯，而非细胞总胆固醇水平可能是影响β-淀粉样蛋白过度合成的因素。β-淀粉样蛋白沉积是阿尔茨海默病（AD）的特征性改变，以海马部位最为明显。因此，探寻调节胆固醇酯化关键酶的药物可能是防治AD的可行思路。

银杏叶提取物EGB761在临床上被广泛应用于预防AD，然而其具体作用机制尚未阐明[1]。笔者假定EGB761通过调节胆固醇酯化关键酶的表达，从而影响β-淀粉样蛋白合成，是其防治AD的机制之一，并参照Sparks等[2]方法复制AD家兔模型，观察EGB761，对ACAT1和LCAT表达的影响，为EGB761的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 银杏叶提取物EGB761（商品名：金纳多），德国威玛舒培博士药厂，批号:9840808。辛伐他汀（商品名：赛夫丁），南通华山药业有限公司，批号：081202。其余试剂均为市售分析纯。

1.2 动物模型的建立 39只健康成年雄性新西兰大白兔（军事医学科学院实验动物中心），体质量为（2 356±212）g，先给予普通饲料和自来水适应喂养2周，温度（28±2）℃，湿度为 37%～48%。2周后，随机取出9只作为对照组，饲以普通饲料，直到实验结束，共9周。其余30只家兔参照D.Larry Sparks等[2]方法，采用2%高胆固醇饲料喂养6周，以复制高胆固醇血症家兔的造模[1]。此时对照组血清总胆固醇一般低于60 g/L，其他各组血清总胆固醇若高于1 400 g/L，提示高胆固醇血症模型复制成功，未达到1 400 g/L者则要淘汰出实验。结果30只家兔造模成功28只，淘汰2只，另因高胆固醇血症导致脑部疾患死亡2只。

1.3 实验分组及处理方法 将26只造模成功的家兔随机分为模型组（n＝8），继续给予高胆固醇饲养3周；阳性药辛伐他汀组（n=8），辛伐他汀5 mg/（kg·d）灌胃3周，其余处理同模型组；EGB761组（n＝10），EGB761 50 mg/（kg·d）灌胃3周，其余处理同模型组。药物干预结束后，断头取海马，冷冻待测。

1.4 ACAT和LCATmRNA的表达 采用Trizol试剂盒提取血管总RNA。依试剂盒说明书,采用Taq－Man Reverse Transcrip tion Reagents试剂盒和PCR扩增反应采用SYBR Green PCR MasterMix reagent kits试剂盒和特异性引物（见表1）数据采用2-△△CT相对定量法[1]分析。

1.5 统计学分析采用SPSS16.0 软件包进行分析,数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为有统计学差异。

表1 引物种类和引物序列Tab.1 Primer type and primer sequences

2 结果

外周胆固醇升高可以上调海马ACAT1 mRNA的表达，与对照组相比差异有显著性（P<0.05）。阳性对照药辛伐他汀和EGB761均可下调ACAT1 mRNA的表达，与模型组相比差异有显著性（分别为P<0.05和P<0.01）；EGB761效果优于辛伐他汀（P<0.05）。外周胆固醇有上调海马LCAT mRNA的趋势，但与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。阳性对照药辛伐他汀可进一步上调LCAT mRNA的表达，与模型组相比差异有显著性（分别为P<0.05）；EGB761与模型组相比差异无显著性（P>0.05）。辛伐他汀效果优于EGB761（P<0.05）。（见表2）。

3 讨论

胆固醇酯化家族主要包括ACAT1，ACAT2和LCAT。其中ACAT1是细胞内胆固醇酯化的关键酶，负责调节细胞内游离胆固醇和酯化胆固醇的平衡。ACAT1可促进24s-羟胆固醇形成，过多的24s-羟胆固醇激活γ分泌酶促进β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP）转化为β-淀粉样蛋白。因此，抑制ACAT1表达可以间接抑制β-淀粉样蛋白产生，从而起到治疗AD的效果。与ACAT1作用的靶点不同，LCAT可将细胞外HDL的游离胆固醇酯化，研究发现外周胆固醇升高对LCAT无显著影响。

表2 银杏叶提取物EGB761对AD家兔模型海马ACAT1和LCAT mRNA表达的影响(±s)Tab.2 Effect of Ginkgo biloba extract in EGB761 on the mRNA expression of ACAT1 and LCAT in hippocampus tissue in rabbit with Alzheimer disease(±s)

表2 银杏叶提取物EGB761对AD家兔模型海马ACAT1和LCAT mRNA表达的影响(±s)Tab.2 Effect of Ginkgo biloba extract in EGB761 on the mRNA expression of ACAT1 and LCAT in hippocampus tissue in rabbit with Alzheimer disease(±s)

注:与模型组比较，※P<0.05，※※P<0.01；与辛伐他汀组比较，▼P<0.05。

组别对照组模型组辛伐他汀组EGB761组ACAT1 mRNA 1.13±0.18※2.61±0.67 1.97±0.41※1.07±0.26※※▼LCAT mRNA 0.99±0.25 1.47±0.11 2.42±1.17※1.53±0.59▼n 9 8 8 1 0

本研究首次发现银杏叶提取物EGB761对于细胞外胆固醇酯化关键酶LCAT无调节作用。同时本研究发现，银杏叶提取物EGB761可以有效下调海马细胞内胆固醇酯化关键酶ACAT1 mRNA的表达，这可能是EGB761抑制β-淀粉样蛋白产生的机制之一，然而，其调节效果差于辛伐他汀。EGB761对细胞外胆固醇酯化关键酶LCAT无调节作用。

[1] Le Bars PL,Katz MM,Berman N,et al.A placebo-controlled,double-blind,randomized trial of an extract of Ginkgo biloba for dementis[J].JAMA,1997,278:1327-1330.

[2] D.Larry Sparks.Coronary Artery Disease,Hypertension,ApoE,and Cholesterol:A Link to Alzheimer’s Disease[J].Ann NY Acad Sci,1997,826(13):128-146.

Effect of ginkgo biloba extract EGB761 on the mRNA expression of ACAT1 and LCAT in rabbit with Alzheimer‘s disease

JIANG Xi-juan,LU Bin,MA Dong-ming,et al
（Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

[Objective]To observe whether Ginkgo biloba extract EGB761 can influence the expression of ACAT1 and LCAT mRNA in rabbit with Alzheimer’s disease.[Methods]The male adult New Zealand rabbits were fed by 2%high cholesterol feed in order to establish the model of Alzheimer’s disease.EGB761 was used to treat the rabbits at a dose of 50 mg/（kg·d） for 3 weeks as EGB761 group.Simvastatin was fed at a dose of 5 mg/（kg·d） as a positive control drug.After intervention,the content of lecithin-cholesterol acyl transferase mRNA and cholesterol acyltransferase mRNA in hippocampus was tested by means of real-time quantitative RT-PCR.[Results]The content of ACAT1 mRNA in hippocampus was reduced by Ginkgo biloba extract EGB761,P<0.01 compared with model group.But the content of ACAT1 mRNA was not significant different compared with model group(P>0.05).[Conclusion]Ginkgo biloba extract EGB761 can down-regulate the expression of ACAT1 mRNA in rabbit with Alzheimer’s disease,however,it has no effect on the expression of LCAT mRNA.

ginkgo biloba extract EGB76；Alzheimer’s disease;Lecithin-cholesterol acyl transferase;cholesterol acyltransferase 1

R285.5

A

1672-1519(2011)01-0059-02

天津市自然科学基金资助项目（08JCYBJC10800），高校博士学科点专项基金资助项目（20101210120008）。

姜希娟(1972-)，女，副教授，硕士研究生导师，主要从事中医药防治心脑血管疾病的研究。

范英昌。

2010-12-20）