沙土管、 冷干管真菌染菌检查方法

杨雪清 刘西嘉

（西安利君制药有限责任公司，陕西西安 710077）

1 前言

沙土管和冷干管分别为沙土保藏法及冷冻真空干燥保藏法所制备的物品。其原理为：根据微生物的生理生化特性，人为创造条件使菌体的代谢处于不活跃和生长繁殖受抑制的休眠状态。一般利用菌体的休眠体（孢子、芽孢等）创造最有利于休眠状态的环境条件。如：低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以降低菌体的代谢活动，减少菌种变异、退化、死亡，达到长期保藏的目的。沙土管和冷干管则符合以上条件。在抗生素生产过程中，要将沙土管和冷干管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种种子，然后再进行一系列的扩大培养以及提炼过程，从而获得符合质量要求的抗生素产品。在整个的发酵生产过程中，要求无杂菌污染，保证纯种发酵。这首先要求制备好的沙土管和冷干管必须无杂菌污染。在孢子悬浮液的制备及抽真空等沙土管和冷干管的制备过程要求在无菌条件下进行。如果在制备或保藏过程中存在问题，则有可能造成沙土管和冷干管污染杂菌。在此作者针对制备好的沙土管和冷干管是否污染真菌制定了一种检查方法，该方法有效，方便实用（细菌的检查多用培养液显微镜观察和肉汤无菌试验的方法，以确定生产过程是否污染细菌）。

2 材料及方法

2.1 仪器及设备

灭菌锅、超净工作台、烘箱、接种针、培养皿、三角瓶。

2.2 材料

2.2.1 玫瑰红纳琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、红霉素斜面培养基。

2.2.2 红色链霉菌阳性对照菌（白色念珠菌 黑曲霉）

2.3 检查目的

对于用红色链霉菌沙土管和冷干管所制备的平板上无菌生长或生长的菌落与表1、表2所列的菌落特征不符，判断沙土管和冷干管未污染真菌。

表1 白色念珠菌

表2 黑曲霉

2.4 检查方法

2.4.1 玫瑰红钠琼脂培养基及改良马丁琼脂培养基的灭菌条件为118℃ 30 min，红霉素斜面培养基及0.9% NaCl溶液的灭菌条件为121℃ 30 min。

2.4.2 在无菌操作条件下，将白色念珠菌的新鲜培养物用0.9%无菌NaCl溶液逐级稀释至10-6。分别取10-5、10-6浓度的菌液1 ml置平皿中，注入15 ～ 20 ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基和改良马丁琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基制备2个平皿。

2.4.3 在无菌操作条件下，将黑曲霉的新鲜培养物用0.9%无菌NaCl溶液逐级稀释至10-3。分别取10-2、10-3浓度的菌液1 ml置平皿中，注入15 ～ 20 ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基和改良马丁琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基制备2个平皿。

2.4.4 在无菌操作条件下，取红色链霉菌沙土管米粒大小沙土置于带玻璃珠的5 ml 0.9%无菌NaCl溶液的小三角瓶中，摇匀，制成菌悬液。再用0.9%无菌NaCl溶液逐级稀释至10-3。分别取10-2、10-3浓度的菌液1 ml置平皿中，注入15 ～ 20 ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基和改良马丁琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基制备2个平皿。

2.4.5 在无菌操作条件下，取红色链霉菌冷干管用砂轮划后，打开加入3.5 ml 0.9%无菌NaCl溶液制成菌悬液。再用0.9%无菌NaCl溶液逐级稀释至10-4。分别取10-3、10-4浓度的菌液1 ml置平皿中，注入15 ～ 20 ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基和改良马丁琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基制备2个平皿。

2.4.6 空白对照：在无菌操作条件下，直接给平皿注入15 ～ 20 ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基和改良马丁琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每种培养基制备2个平皿。

2.4.7 在无菌操作条件下，将2.4.4中10-3浓度菌液及2.4.5中10-4浓度菌液分别接种于红霉素斜面培养基平皿中，倒置培养。

2.4.8 以上，2.4.2至2.4.6中所制备平皿置23 ～ 28℃培养72 h，观察菌落生长情况。

2.4.9 2.4.7中所制备平皿置30℃培养5天，观察菌落生长情况。

3 观察结果

用红色链霉菌沙土管及冷干管所制备的两种培养基平皿及空白对照的培养基平皿均无菌落生长，白色念珠菌及黑曲霉所制备的两种培养基平皿上有典型菌落生长。

注：1. “+”表示有典型菌落生长，“—”表示无菌落生长。2. 10-3浓度的沙土管和10-4浓度的冷干管在红霉素斜面培养基平皿中有正常菌落生长。

4 结论

用白色念珠菌和黑曲霉做阳性对照菌，分别用红色链霉菌沙土管及冷干管、白色念珠菌、黑曲霉做平板，并做空白对照。在适当温度下培养一定时间，观察菌落生长情况。结果为沙土管、冷干管及空白对照平板上无菌落生长，阳性对照菌平板上有典型菌落生长。从而认定沙土管和冷干管未污染真菌。并且，确定此真菌染菌检查方法可行、实用。

[1] 吴剑波主编. 微生物制药[M]. 北京：化学工业出版社, 2002.

[2] 山东济宁抗生素厂主编. 《抗生素工业生产》. 中国医药工业公司, 1981.9.

[3] 熊宗贵主编. 发酵工艺原理[M]. 北京：中国医药科技出版社, 2005.