红曲霉粗多糖的提取及含量测定

2011-02-27高鑫黄先智李竞

中国合理用药探索 2011年3期

高鑫黄先智李竞

（1西南大学药学院，重庆400715；2西南大学蚕学与系统生物学研究所，重庆400715）

红曲霉（Monascus）在我国的应用已经有一千多年的历史[1]，以能产生大量的天然红色素而著称。红曲霉广泛应用于酿酒、酿醋、食品发酵、化妆品、医药等行业[2]。近几十年来世界各地对红曲霉进行了大量研究，上个世纪70年代，日本远藤章教授从红曲霉中分离出Monaclin K，具有降胆固醇作用[1]，引起了广泛关注。随着人们的食品安全意识的日益提升，红曲霉生产的红色素在绿色食品中得到广泛应用。

近些年来，经科学工作者的研究证实，红曲霉多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、增强免疫等功能[3]。本实验通过提取红曲霉发酵液和菌丝体内的粗多糖，并对其进行含量测定，以期为红曲霉多糖的进一步开发利用提供参考。

1 材料与试剂仪器

1.1 材料

红曲霉菌种购自中国农业微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号：30344。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基母种培养基为斜面PDA培养基。

1.2.2 液体摇瓶培养基普通PDA培养基去琼脂配方，MgSO41.5mg/L，KH2PO41.5 mg/L，VB110mg/L，自然pH。

1.3 仪器与试剂

ZD-85A气浴恒温振荡器（金坛市富华仪器有限公司）、RE-52旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、U-1800紫外分析仪（日本日立）、752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、SHZ-ⅢD型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）、KQ2200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、HH-6数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）。三氯乙酸、苯酚、碳酸氢钠、浓硫酸、葡萄糖、铝片、活性炭等，所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 操作与培养方法

刮下斜面红曲霉菌丝体，放入已灭菌的研钵中，研成碎块，加入少许无菌水，研成均匀糊状，精密吸取3 m L加入含有350 m L液体培养基的锥形瓶中，封口，整个操作过程在无菌操作台内完成。将5个摇瓶放在25℃，170转/min的摇床上往复式振摇7天。

2.2 红曲霉粗多糖的提取

发酵液滤过，得菌丝体，加入水500 m L，超声破碎细胞1小时，滤过，菌丝体加入500 m L水100℃浸提2次，每次1小时。合并4次滤液，减压浓缩至100 m L，用10%三氯乙酸溶液调节pH至3，滤液放置冰箱24小时后，经微孔滤膜滤过去蛋白质沉淀，滤液加入乙醇，使含醇量达到80%，静置过夜。经微孔滤膜减压抽滤，滤渣加热水中溶解，依上法进行醇沉，重复3次。滤渣加热水溶解，加入1 g活性炭粉末除去色素，滤液浓缩醇沉，滤过，得浅红色红曲霉粗多糖，多糖平均得率为0.42 g。

2.3 红曲霉多糖含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品25.78 mg，置25 m L量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 5%苯酚溶液的制备[4-5]取苯酚100g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏。收集182℃馏分5g，置100 m L量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，避光保藏在冰箱中备用。2.3.3 供试品溶液的制备精密称取红曲霉粗多糖9.68mg，置10m L量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.4 吸收波长的选择分别精密吸取对照品溶液0.3 m L、供试品溶液0.2 m L，置10 m L量瓶中，加水至3 m L，精密加入5%苯酚溶液1 m L，摇匀；精密吸取硫酸5 m L迅速加入，振摇。冷却后于沸水中加热15分钟，取出后冷却，加水至刻线，摇匀。在400～550 nm进行波长扫描，得对照品溶液、供试品溶液的最大吸收波长都在490 nm，见图1和图2。

图1 对照品溶液波长扫描图

图2 供试品溶液波长扫描图

2.3.5 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液0μL、50μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL，置 10 m L量瓶中，加水至3 m L；精密加入5%苯酚溶液1 m L，摇匀；精密吸取硫酸5 m L迅速加入，振摇。冷却后于沸水中加热15分钟，取出后冷却，加水至刻度，摇匀。以相应的试剂为空白，在490 nm波长处测定吸光度。葡萄糖浓度 C分别为 0.005 2、0.010 4、0.020 8、0.031 2、0.041 6、0.052 0 mg/m L，其吸光度A值分别为0.110、0.180、0.324、0.439、0.590和0.699，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：A＝12.784 C＋0.049 8，r＝0.999 1。结果表明：葡萄糖浓度在0.005 2～0.052 0 mg/mL范围内，吸光度与浓度具有良好的线性关系。

2.3.6 精密度试验精密吸取对照品溶液连续测定6次，结果吸光度A的RSD为0.26%，表明实验仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验将供试品溶液，依法显色后，每隔0.5小时测定吸光度A一次，连续测定6次。结果A值的RSD为0.67%，表明显色后的样品溶液在3小时内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验精密称取红曲霉粗多糖6份，制成供试品溶液测定其含量，红曲霉粗多糖中多糖的平均含量为63.81%，RSD为1.73%。

2.3.9 加样回收率试验取已知含量的样品6份，分别按样品中多糖含量的80%、100%、120%比例加入葡萄糖对照品溶液，平行操作2份，再按供试品溶液制备方法制备6份，测定其吸光度，计算回收率，结果见表1。根据所得结果，表明本法具有良好的回收率。

2.3.10 样品含量测定取红曲霉粗多糖样品5份，按照2.3.3项操作配制，精密吸取样品溶液0.2 m L，按照2.3.5项配制样品溶液，测定吸光度A值，计算出红曲霉粗多糖中多糖的平均含量，结果见表2。