固定化脂防酶在非水相合成中的应用

孙月娥，王卫东(徐州工程学院食品学院，江苏徐州221008)

固定化脂防酶在非水相合成中的应用

孙月娥，王卫东*(徐州工程学院食品学院，江苏徐州221008)

脂肪酶是分解脂肪的酶，非水体系可促使反应平衡逆向进行，因而脂肪酶又具有合成功能。目前非水相脂肪酶催化合成技术在食品、医药、化妆品等多个领域中都有广泛的应用。本文对非水相中脂肪酶的反应体系、影响非水相酶促反应的因素以及其应用领域进行了综述，对于深入研究非水体系中脂肪酶催化的合成反应具有较强的参考价值。

脂肪酶，非水相，合成

脂肪酶具有多种催化能力，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、酯交换及酯类的逆向合成反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业［1－2］。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力，脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系，在油水界面促进酯水解，而非水体系可以使反应热力学平衡从水解反应转为其逆反应，因而在有机相中可以促进酯合成和酯交换［3－4］。目前非水相脂肪酶催化合成技术在食品及相关领域已得到了广泛的应用，其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶催化的生物合成代表了未来产业的发展方向。

1 非水相酶学概况

传统观念认为酶只能在水溶液中发挥催化作用，但自从1986年Klibanov发现许多酶能在接近无水的有机溶剂中进行有效催化以来，非水相酶学研究取得了长足发展，酶学领域诞生了一个全新的学科方向——非水酶学。

1.1 酶在非水介质中的特性

有机相中酶促反应，除了具有水相中酶的催化优点外，还具有以下特点:可以催化水相中很难进行的疏水性物质的反应;酶的热稳定性显著提高;抑制有水参与的副反应(如酯水解)，可使某些反应的热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、酯交换等;产物从低沸点的溶剂中分离纯化比从水中容易;酶不溶于有机溶剂，容易回收再利用;没有微生物的污染;可以控制底物专一性等。

1.2 酶的固定化

游离脂肪酶在有机溶剂中不溶解，反应过程中容易结块，使用后不易回收重复利用，产物也不易分离，实际应用中常对酶进行化学修饰或固定化。虽然酶固定化后，其催化作用由均相转移到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质等因素对酶的性质产生影响，但是固定化酶与游离酶相比，具有很多优点:可以扩大酶与底物的接触面积，提高酶的热力学稳定性，可以调节和控制酶的活性和选择性，有利于将固定化酶与底物、产物分开，可以重复利用和装柱连续化生产，促进脂肪酶催化技术的工业化。

2 非水相酶催化的反应体系

2.1 水－有机溶剂两相体系

酶溶解于水相，底物和产物溶解于有机相，酶与有机溶剂在空间上的分离，使酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂相接触。水－有机溶剂两相体系已成功地用于强疏水性底物如甾体、脂类和烯烃类的生物转化［5］。

2.2 微水有机溶剂单相体系

分为水不互溶有机溶剂单相体系和水互溶有机溶剂单相体系。前者是用与水不互溶的有机溶剂取代所有的溶剂水(>98%)，形成固相酶分散在有机溶剂中的单相体系，酶表面残余的结构水，可以保证酶的催化活性。该体系中，溶剂容易夺取酶维持构象所必需的水，导致酶失去活性。水互溶有机溶剂单相体系是由与水互溶的有机溶剂组成，酶、底物、产物均能溶解于该体系中，主要用于亲脂性底物的生物转化。

2.3 反胶束体系

是表面活性剂与少量水存在的有机溶剂体系。水分子聚集在反相胶束内核中形成“小水池”，可增溶蛋白质和酶，酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。由于反胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中，大多数酶能够保持催化活性和稳定性，甚至表现出“超活性”(superactivity)［6］。

2.4 超临界流体体系

二氧化碳、烷烃类(甲烷、乙烯、丙烷)等超临界气体在临界点附近的温度或压力有一点微小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调控超临界气体中酶催化反应的特性。Palocci等［7］对三苯甲基吡喃葡萄糖苷在超临界二氧化碳中合成进行了研究。与有机溶剂相比，底物的溶解性更好，溶剂回收彻底，可以获得高纯度产物。该体系的缺点是需要高压容器，并且减压时易使酶失活。

2.5 固相合成

是直接以底物作为反应介质的完全不用溶剂的无溶剂酶催化反应体系，由于没有溶剂的稀释作用，提高了反应底物浓度，反应速度快，产物收率高，后处理简单，环境污染小，是一种极具潜力的清洁反应新技术［8］。

2.6 离子液体

是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的低熔点盐类，具有可忽略的蒸汽压力、不挥发性、高(热、化学)稳定性及对环境友好等特性。另外，离子液体的极性、疏水性、粘度及溶解性均可通过其阳离子和阴离子的适当修饰来调节。Adamczak等［9］对离子液体中油酸抗坏血酸酯的合成条件进行了优化。离子液体可提高酯化反应的选择性，但离子液体的粘度高于有机溶剂，影响底物和产物的传质速度，也增大了反应液过滤和酶分散的难度。

3 影响非水相中脂肪酶催化活性的因素

3.1 脂肪酶

脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，具有对油－水界面的亲和力，并在界面上表现最大活力。不同来源的脂肪酶在结构上具有明显的差异，在催化不同底物时的活性相差很大，即使来源相同但固定化方法不同都会导致脂肪酶活力的差异，恰当地选择脂肪酶的种类对催化反应的效率至关重要。

3.2 水分活度

由于不同体系中水与底物、介质的作用不同，相同的含水量所起的作用未必相同，因此一般用水分活度来更真实地反映体系中水和其他组分之间的关系。水分活度是影响酶催化反应活性和反应平衡的最大因素，在绝对无水体系中的酶不表现催化活性［10］。

3.3 反应介质

水溶性和非水溶性的有机溶剂均可作为酶促合成的反应介质，但不同溶剂对酶和酯化反应速度有不同的影响。丙酮、乙腈和叔丁醇等水溶性有机溶剂有利于糖等亲水性底物的溶解，但它们可能摄取酶分子中保持其催化活性所必需的水，从而降低酶的活性，甚至使其失活［11］。己烷和异辛烷等疏水的非极性溶剂有助于保持酶的催化活性，但不利于糖的溶解，合成反应速度极其缓慢［12］。此外，溶剂的极性对产物的平衡转化率也有一定的影响。因此，有机溶剂的选择要综合考虑如下因素:对酶活的影响、底物和产物的溶解性、挥发性、毒性及反应后处理等。

3.4 底物

Xiao等［13］报道在叔丁醇和嘧啶的混合溶剂中用NOV 435催化合成蔗糖酯时，初始酯化速度和糖酯的产率随着脂肪酸链长的缩短而上升。由于只有溶解于溶剂的糖才能有效地参与酯化反应，而不同的糖在有机溶剂中的溶解度不同，因此糖也可对合成糖酯的酯化反应速度产生重要影响。此外，底物的摩尔比和浓度也对酶促反应产生影响，底物摩尔比影响反应平衡，而底物的浓度则直接影响到酶的催化活性，因此确定合适的底物摩尔比和浓度十分重要［14］。

3.5 反应温度和时间

反应温度是影响化学平衡常数的重要参数，温度不但影响酶的热稳定性和催化活性，也影响底物的状态以及产物的传质速度。提高反应温度可提高底物的溶解度，降低溶液的粘度，加快传质过程，促进底物与酶的有效接触，加快化学反应的速度［15］，但高温会加速酶活损失。为了得到尽可能多的产物，延长反应时间是最为简便经济的方法。然而当反应进行到一定时间时，转化率趋于恒定，此时单纯的延长反应时间只能是增加生产成本。

除了上述因素外，还有许多因素影响酶催化效率，例如，摇床振荡速度关系到外扩散限制，加酶量关系到反应的经济性等。

4 非水相脂肪酶催化技术的应用

非水相酶学的发展极大地促进了酶在有机合成中的应用。据报道，已有包括脂肪酶、蛋白酶等在内的十多种酶用于有机溶剂中的催化反应，但研究最多的还是脂肪酶。

4.1 合成表面活性剂

目前在非水介质中利用固定化脂肪酶催化技术已成功地合成了葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、麦芽糖和蔗糖等的脂肪酸糖酯［15－17］，非水相酶法合成技术得到了长足发展。日本及德国在90年代开发的酶法生产单甘酯新工艺，目前已实现了规模生产。

4.2 合成营养强化剂

多不饱和脂肪酸(PUFA)具有防治心脑血管疾病、降低糖尿病、高血压和癌症发病率、增加免疫力等许多生理功能，但长链PUFA的吸收有一定困难，利用非水相脂肪酶催化合成PUFA的酯，促进PUFA的吸收具有应用意义。Cardan等［18］在固定化脂肪酶的作用下，合成了富含PUFA的鳕鱼肝油甘三酯。Akimoto等［19］对大豆油与沙丁鱼中PUFA浓缩物之间的酯交换反应进行了研究。

4.3 生产人造奶油和类可可脂

脂肪酶可在相对温和的条件下催化油脂间的转酯或酯交换，增加油脂中饱和脂肪酸的量，从而获得质量较好的人造奶油。脂肪酶催化油脂间酯交换生产可可脂亦被人们广泛关注，Wang等利用固定化脂肪酶催化茶籽油、棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯间的酯交换反应制备了可可油类似物［20］。

4.4 生物柴油

生物柴油是一类以天然植物油为原料制成的脂肪酸单酯，具有环保清洁、可再生、安全性好等优点，是一种真正的绿色能源，可完全替代矿物油作为燃料［21］。用生物酶催化法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、无污染物排放;副产品甘油的回收较易，操作方便;反应物中的游离脂肪酸能完全转化成酯等优点。

4.5 合成天然风味物质

固定化脂肪酶也被用于芳香酯的合成。乙酸乙酯、丁酸异戊酯、安息香甲酯等低分子量芳香酯多呈天然水果香味，广泛应用于食品工业中。Krishna等利用固定化脂肪酶催化合成了乙酸异戊酯［22］。

4.6 生产护肤产品

维生素A及其衍生物在化妆品及制药学如护肤产品极具商业潜力，还是重要的添加剂，广泛用于食品、饲料的营养强化。但VA非常不稳定，通过在有机溶剂中用脂肪酶催化VA产生视黄醇酯，可增大其稳定性［23］。抗坏血酸是应用广泛的天然抗氧化剂，但是它的高度水溶性限制了它在化妆品或油脂中的应用，近年来许多学者通过固定化脂肪酶对其进行酯化，从而改变它在油基产品中的溶解性［24］。

5 结语

自从非水酶学诞生以来，固定化脂肪酶在非水相合成中的应用已有很多报道，目前已有工业化的吐温系列、司盘系列以及单甘酯系列的表面活性剂上市，并在食品、医药、化工等产品中得到广泛的应用。近年来在非水介质中利用脂肪酶合成脂肪酸糖酯成为研究热点，并已有工业化的蔗糖酯系列产品投入使用。除了饱和脂肪酸因其稳定性好成为最常采用的原料外，不饱和脂肪酸的功能特性以及一些特殊的使用性质使其成为新的研究焦点。在市售的商品中，司盘80和吐温80就是山梨糖醇(衍生物)的单油酸酯，在食品中可用作乳化剂;油酸单甘酯是性能优异的赋脂剂，已经用于护肤品、护发品、沐浴露等产品中;生物柴油的合成也使用了富含不饱和脂肪酸的动植物油脂。随着对脂肪酶基因工程和其在非水相中催化机理的深入研究，脂肪酶在非水相中的应用将会有更加光明的前景。

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Application of immobilized lipase in nonaqueous synthesis

SUN Yue－e，WANG Wei－dong*
(College of Food Engineering，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221008，China)

Lipase can catalyse the hydrolysis of triglycerides at the oil/water interface，but their ability to form ester bonds under reverse hydrolytic conditions enables them to catalyse various other types of reactions such as esterification and transesterification in organic solvents.Now it has been widely used in food，pharmaceutical，cosmetic and detergent industries.As a consequence of their versatility in application，lipases are regarded as enzymes of high commercial potential.Here we reviewed the reaction system，factors influencing the synthesis in non－aqueous media and application of lipase，which provided a promising prospect for further study lipase－catalysed synthesis in non－aqueous media.

lipase;non－aqueous media;synthesis

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)04－0409－04

2010－10－12 *通讯联系人

孙月娥(1973－)，女，博士，讲师，研究方向:食品脂质氧化。