茯砖茶中“金花”菌产蛋白酶特性的研究

丁 婷， 吕嘉枥， 侯 蓓

(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引 言

茯砖茶，主销西北少数民族地区，能“消腥肉之腻，解青稞之热”.关于茯砖茶利于消化的研究已有报道[1-4].“金花菌”是茯砖茶的优势菌，在茯砖茶上长有大量金黄色颗粒，俗称“金花”.而茯砖茶这一功能与生长在其表面的“金花”菌密不可分[5,6].本文通过研究“金花”菌产蛋白酶酶活，证明“金花”菌对促进人体消化功能有一定的作用，为进一步研究“金花”菌在调理人体消化功能提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 菌种

从陕西苍山茶叶有限公司提供的茯砖茶表面分离纯化得到的菌种.

1.2 材料

1.2.1 主要设备与试剂

设备:电子天平,分析天平,高压蒸汽灭菌锅,恒温干燥箱，超净工作台，电热恒温培养箱,恒温水浴锅,紫外可见分光光度计,高速冷冻离心机.

试剂:Folin-酚试剂、三氯乙酸、碳酸钠、乳酸(80%～90%)、乳酸钠、干酪素等，干酪素为化学纯外，其余均为分析纯.

1.2.2 培养基

斜面培养基：蒸馏水1 000 mL，pH自然.

基础培养基：在250 mL的三角瓶中加入10 g麸皮及10 mL水拌匀，121 ℃高温蒸汽灭菌30 min ,趁热摇散,冷却后接种1 mL“金花”菌悬浮液.

1.3 方法

1.3.1 酪氨酸标准曲线

配置各种不同浓度的酪氨酸溶液，分别取1.0 mL，加入0.4 mol/L的碳酸钠溶液5.0 mL，再加入稀释的福林试剂1.0 mL，摇匀后置于40 ℃水浴显色20 min取出，冷却后在680 nm处测量吸光度.

1.3.2 粗酶液的提取

将三角瓶中的种曲，放入研钵中充分研细，加入10倍的水在40 ℃水浴间断搅拌1 h．取浸提液用三层纱布过滤，将滤液在6 000 r/min 中离心10 min，取上清液进行蛋白酶活的测定.

图1 酪蛋白标准曲线

1.3.3 缓冲液的制备[7]

酸性缓冲液：pH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液.

中性缓冲液：pH7.2磷酸盐缓冲液.

碱性缓冲液：pH10硼砂-氢氧化钠缓冲液.

1.3.4 酶活力的测定

在3支平行试样管中，取经40 ℃加热2.0 min的酶液1.0 mL，加入酪蛋白溶液(加入的酪蛋白以所测量的蛋白酶的性质而定)1.0 mL，于40 ℃恒温反应10 min，立即加入0.4 mol/L三氯乙酸溶液2.0 mL终止反应．空白对照管以先加入三氯乙酸溶液后加酪蛋白溶液来终止反应．反应结束后，继续置于水浴中保温20 min ，使残留的蛋白质沉淀后在10 000 r/min离心10 min，取上清液1.0 mL，以下步骤同酪氨酸标准曲线绘制一致.

酶活力的单位定义为在上述条件下,每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个酶活单位.

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

在酪氨酸浓度为0～100 mg/L范围内测定其OD值，结果表明其线性较好， 得到回归方程为y=0.01x+0.005 6,R2=0.999 8.

2.2 菌的生长及产酶动态

在基础培养基中接种，在28 ℃的恒温培养箱中培养，每隔12 h测定种曲产酸性、中性与碱性种蛋白酶活力.由图2可知，“金花”菌以产中性与碱性蛋白酶为主，产酸性蛋白酶酶活非常低，因此在以下的实验中以考察“金花”菌产中性及碱性蛋白酶，产中性、碱性蛋白酶的酶活在7 d达到最大.“金花”菌的孢子在培养7 d后大量长成，最高酶活也出现，说明产酶与孢子长成有一定的联系.中性与碱性蛋白酶酶活开始快速增长的时期是4.5 d，这个时间正是孢子开始生长的时期，“金花”菌的生长周期比较长造成其产蛋白酶的峰值比较晚.

图2 培养时间与酶活的关系 图3 碳源对产酶的影响

2.3 固态发酵培养基的优化

2.3.1 最适碳源的选择

碳源是微生物生长的重要元素，在基础基中添加浓度为2%的蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉，以不添加碳源为对照，在28 ℃下培养7 d后，分别测定中性与碱性蛋白酶的酶活如图3所示.

结果显示，“金花”菌对碳源的利用广泛，添加各种碳源都对蛋白酶有促进作用，其中乳糖较其他碳源更有利于“金花”菌产中性、碱性蛋白酶，可能是乳糖对于蛋白酶的合成有诱导作用.

2.3.2 最适氮源的选择

在选定的最适碳源培养基中分别添加浓度为1%的牛肉膏、酵母粉、大豆粉，以不添加氮源为对照，在28 ℃下培养7 d后，分别测定中性与碱性蛋白酶的活力.

由图4可知，对照组的蛋白酶酶活最大，添加各种碳源都不利于蛋白酶的产生，可能对于“金花”菌的固体培养麸皮作为氮源更有利于“金花”菌的生长，对于其孢子的产生更有利.因此在下面的实验中以麸皮为氮源，不用再添加氮源.

图4 氮源对产酶的影响 图5 无机盐对产酶的影响

2.3.3 最适无机盐的选择

由于添加的氮源对“金花”菌产蛋白酶没有促进作用，因此在选定的最适碳源培养基上分别添加浓度为1%无机盐的，以不添加无机盐为对照，在28℃下培养7d后，分别测定中性与碱性蛋白酶的酶活.

由图5可知，除硫酸锌外，添加各种无机盐都对“金花”菌产碱性蛋白酶有促进作用，除氯化钠外，其他无机盐均对“金花”菌产中性蛋白酶没有促进作用.以添加氯化钠的蛋白酶的酶活最高.说明其对“金花”菌产中性及碱性蛋白酶有促进作用，这可能是因为添加一定量氯化钠的有利于“金花”菌孢子的产生.

3 结束语

作者通过对“金花”菌产蛋白酶条件的研究，确定该菌以产中性与碱性蛋白酶为主，且在培养的第7 d酶活均达到最大.产酶培养基的最适碳源为乳糖、最适氮源为麸皮、最适无机盐为氯化钠.在最适培养基下产中性蛋白酶的酶活力可达到237 U/g，产碱性蛋白酶的酶活力可达到236 U/g.该研究进一步证明了“金花”菌对茯砖茶的促消化功能有一定的促进作用.

参考文献

[1] 傅冬和,刘仲华,黄建安,等.茯砖茶不同萃取物对消化酶活性的影响[J].茶叶科学，2008,28(1):62-66.

[2] 刘勤晋,司辉清,钟颜麟,等.黑茶营养保健作用的研究[J].中国茶叶,l994,6:36-37.

[3] 傅冬和,刘仲华,黄建安,等.高通量筛选研究茯砖茶降脂功效[J].茶叶科学,2006,26(3):209-214.

[4] 肖文军,任国谱,傅冬和,等.茯茶辅助调节血脂作用研究[J].茶叶科学,2007,27(3):211-214.

[5] 邓放明. 茯砖茶中冠突散囊菌分离培养及其发酵液胞外多糖与应用酶学研究[D]. 长沙:湖南农业大学硕士学位论文, 2007:26-31.

[6] 尹旭敏. 四川“金花”菌生物学特性及其发酵液态茶工艺的初步研究[D]. 成都:四川农业大学硕士学位论文, 2006:42-58.

[7] 张树政. 酶制剂工业[M]. 北京:科学出版社,1998.