真菌GXM生物学活性及影响因素的研究进展

聂建巍 杨蓉娅

(1.北京军区总医院全军皮肤病诊治中心，北京 100125;2.安徽医科大学，安徽 230032)

GXM(glucuronoxylomannan)即葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖。目前研究发现GXM仅存在于毛孢子菌的细胞壁和新生隐球菌的荚膜中，尚未在其他真菌中发现。GXM是阿萨希毛孢子菌细胞壁的重要成分，也是重要的代谢产物，是真菌生长时脱落到培养基质中的分泌性多糖［1］。GXM是新生隐球菌荚膜中含量最高的多糖，占荚膜成分的90%以上［2］。GXM是高分子量的多糖，具有抗原性，由6种不同的重复多糖单位组成的乙酰化的线性多糖，其主要成分是甘露糖三糖基序，含有一个β(1，2)葡萄糖醛酸基团和不同含量的β(1，2)、β(1，4)吡喃木糖。患者在抗真菌治疗成功之后，仍然可以用ELISA法检测到GXM抗原［3］。

1 GXM的生物学活性

1.1 毒力与致病性

新生隐球菌主要侵犯人的中枢神经系统，在感染隐球菌患者的脑脊液中可以检测到GXM，但因隐球菌属荚膜多糖与毛孢子菌属细胞壁成分有交叉反应性［4］，应注意两者的鉴别。GXM是重要的毒力因子，McFadden等［5］在研究新生隐球菌的结构时发现GXM是以共聚合的方式形成的，GXM的生化组成和乙酰化状态可以随着代谢状态和环境的变化而改变，产生多种多样的荚膜多糖分子，从而改变抗原性。而抗原性的改变有利于逃避免疫系统的识别和杀伤，对于隐球菌在宿主体内的存活非常重要，GXM分子的多样性也与毒力有着密切的联系［6］。

Vecchiarelli［7］在研究新生隐球菌患者的血清和脑脊液时检测到高水平的荚膜多糖抗原。GXM之所以被认为是荚膜多糖的主要致病因子，是因为在患者感染期间荚膜多糖GXM被释放到组织中广泛累积，宿主缺乏对荚膜多糖的反应性等，最终引起相应部位的毒性反应［8］。

1.2 免疫活性

GXM可以干扰抗原提呈细胞、白细胞的募集，抑制宿主的免疫、炎症反应，逃避机体免疫系统的杀伤［9］。

诱导T细胞凋亡 目前研究表明具有抗真菌感染的 Toll样受体 (TLR)主要为 TLR2和TLR4。Yauch［10］等对各种 TOLL 样受体的作用进行研究时发现TLR2参与对酵母聚糖的识别与吞噬。GXM经TLR4与CD14的识别后可激活NF-кB的转录;GXM与TLR4结合，可上调巨噬细胞表面的Fas配体，诱导Fas的表达和Jurkat T细胞的凋亡。

抑制T细胞活化、增殖 Monari等［11］通过对抗CD3抗体、刀豆蛋白A的研究发现GXM直接抑制T细胞的增殖。树突状细胞 (Dendritic cells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC可以高表达MHCⅠ类和MHCⅡ类分子、CD80、CD40等，有效激活初始型T细胞，其中MHCⅡ分子可以与抗原肽结合并提呈给T细胞。但有荚膜的菌株不能激发树突状细胞Ⅰ类、Ⅱ类和CD83分子的表达，可溶性的GXM荚膜多糖不能激发树突状细胞MHCⅠ类、Ⅱ类分子的表达，两者皆能干扰DC的成熟、活化，且GXM能限制抗原肽与T细胞的结合，从而抑制了T细胞的增殖、活化［12-13］。

抑制单核细胞分泌致炎因子 Monari等［14］在感染新生隐球菌患者的体液中发现，GXM可以诱导分泌TNF-α、IL-10，从而产生免疫抑制作用;GXM下调IL-12的生成，引起IFN-γ等Th1细胞因子减少，从而抑制保护性的Th1细胞的免疫应答。

1.3 抗吞噬性

新生隐球菌荚膜中的GXM成分可以干扰补体介导的巨噬细胞对菌体的吞噬过程，从而起到抵抗吞噬的作用［15］。Rodrigues 等［16］在研究新生隐球菌的荚膜时发现无荚膜的突变株比有荚膜的野生株毒性弱，新生隐球菌突变株本身对GXM的分泌是有缺陷的，但是当新生隐球菌的突变株在阿萨希毛孢子菌的上清液中培养时发现新生隐球菌的荚膜突变体包被上了阿萨希毛孢子菌细胞壁分泌的GXM，显示了阿萨希毛孢子菌有与新生隐球菌野生株相似的抵抗巨噬细胞吞噬的特性。然而，GXM保护毛孢子菌细胞抵抗巨噬细胞的吞噬尚未得到证明。

1.4 合成与转运

新生隐球菌的荚膜多糖是在细胞内的高尔基体内合成的［17］。Rodrigues等［15］研究表明新生隐球菌荚膜中的GXM也是在高尔基体中合成，然后包装成小囊泡，这些小囊泡脱离细胞壁到达细胞外间隙，GXM在细胞外间隙参与荚膜的形成或者是被运送到宿主细胞、组织中。Oliveira等［18］在研究多糖的合成与转运过程中发现，GXM与细胞内及细胞外间隙的膜相关的转运结构——脂质直接相关。

2 影响GXM形成的因素

2.1 物理因素

二价金属离子 GXM聚合物表面的葡萄糖残基所带的负电荷与二价金属离子之间的相互作用形成交联桥。当GXM在不同浓度的Ca2+、Mg2+盐酸盐溶液中培养时，发现这些金属离子结合到多糖上的能力与自身的数量呈剂量依赖性关系。隐球菌用Ca2+、Mg2+盐酸盐处理后，随着二价金属离子含量的增多，GXM表面的负电荷逐渐降低，证实了二价金属离子是结合到带负电荷的多糖上的。Nimrichter等［19］在研究新生隐球菌的荚膜多糖时发现荚膜的扩大在培养基中受Ca2+的影响，荚膜的聚集实质上是细胞外的GXM分子由二价阳离子介导的自我聚集，Ca2+可以调节GXM的自我聚集能力。用氯化钙处理后的结果显示Ca2+浓度在0.000 1～0.1 mmol/L时荚膜多糖的黏度增加，当浓度在0.1～10 mmol/L时荚膜多糖黏度降低，具体机制尚不清楚。

温度、时间、培养介质 在不同情况下阿萨希毛孢子菌产生GXM的能力是不同的，Fonseca等［4］在研究阿萨希毛孢子菌细胞壁和胞外分泌的GXM时发现，37℃生长条件下其表达下调。由于人类正常体温在37℃左右，所以阿萨希毛孢子菌与新生隐球菌相比，前者的发生率比较低。Diane等［20］在37℃人血清中培养4周后发现，GXM失去了91%的反应活性;45℃培养4周后丧失了99%的反应活性。分别在37℃和45℃培养4周后用乳胶凝集法测得GXM的滴度下降。在37℃培养4周后，磷酸盐缓冲液 (PBS)、胎牛血清 (FBS)中的GXM的反应活性差异并不显著，但是在水中的活性较前两者降低;在45℃培养4周后，GXM的反应性在PBS、FBS、水中依次降低。

2.2 化学因素

二甲亚砜 McFadden［5］等用二甲亚砜处理阿萨希毛孢子菌细胞壁后发现细胞壁变得不稳定。二甲亚砜处理的阿萨希毛孢子菌没有被抗GXM的抗体识别，解释此结果可能是因为GXM抗原释放出来并发生解离，而不是缺乏对抗体的反应性，因为二甲亚砜处理的上清液经过透析、纯化后仍然可以被可溶性抗-GXM的单克隆抗体MAb18B7识别。新生隐球菌与DMSO共同孵育后发现GXM比例大大减少，与此同时荚膜体积降至 (65±8)μm3，而未用DMSO处理的荚膜体积则为 (1 276±95)μm3［21］。

几丁质酶 几丁质酶是重要的水解酶，它可以降解真菌细胞壁中的几丁质。Fonseca等［4］用几丁质酶处理阿萨希毛孢子菌的细胞壁后发现，GXM从细胞壁中释放出来，随着几丁质酶剂量的增加，GXM释放也增加。在PBS中孵育阿萨希毛孢子菌后取上清液作为对照，在相同的缓冲液中加入几丁质酶作为实验组，实验组阿萨希毛孢子菌上清液中释放的GXM显著增多。Rodrigues等［22］用几丁质酶处理新生隐球菌细胞壁后发现结果与阿萨希毛孢子菌相似，荚膜中GXM的释放呈剂量依赖性。GXM从细胞壁中释放出来，荚膜体积减小与GXM释放呈正相关。

2.3 菌株与表现型

Karashima等［23］在培养阿萨希毛孢子菌临床株时发现，其上清液中释放的GXM抗原显著高于环境株中释放的GXM抗原，所以临床株GXM的抗原滴度比环境株的GXM抗原滴度要高。与原代的环境株相比，在所有的传代菌株中GXM抗原滴度显著增高。Fries等［24］发现减毒的新生隐球菌24067A株存在三种表现型:皱褶型菌落 (WR)、平滑型菌落(SM)、假菌丝状菌落 (PH)。三者毒力依次为:WR＞PH＞SM，产生的GXM滴度依次为:WR＞PH＞SM。

3 展 望

真菌的毒力和发病机制一直是研究的热点问题。GXM与真菌的致病性密切相关。目前GXM单克隆抗体正处于临床试验阶段，治疗性的GXM单克隆抗体将成为抵抗致病性真菌感染的有利武器。可溶性的GXM单克隆抗体通过形成抗原-抗体复合物被网状内皮吸收，脑脊液和血清中的GXM水平明显降低［25］。深入研究GXM可以为真菌的致病性提供更加可靠的理论依据。另外，GXM有助于了解疾病的进展、治疗后的反应及预后情况。本文通过对真菌GXM的生物学活性以及影响因素的总结，以期更好的了解和分析GXM的毒力及发病机制，为控制真菌感染和疾病治疗提供更多的研究依据。

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