表没食子儿茶素没食子酸酯对亚硫酸盐诱导的心肌细胞氧化损伤的抑制作用

赵良渊，张秋华

(1.山西医科大学药学院，山西太原 030001;2.山西大学环境与资源学院 030006)

绿茶常被称为是天然的抗氧化剂，含有很多种酚类物质，其中以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量最高且生物活性最强。流行病学调查和实验室研究表明，EGCG具有清除自由基、抗氧化、抗癌、抗肿瘤等功效［1-2］，如在日本等饮茶较多的国家或地区，冠心病等心血管疾病的发病率是非常低的［3］。近年来，关于EGCG 的抗氧化机制被广泛接受的是具有较强的抗氧化能力［4］。关于EGCG对心血管系统的保护机制报道不多，本实验主要研究了EGCG对亚硫酸盐诱导心肌细胞氧化损伤的抑制作用。

1 材料与方法

1.1动物实验动物Wistar大鼠，200～300 g，♀♂不限，由山西省中医药研究院动物房提供。

1.2大鼠心肌细胞的分离Wistar大鼠，体质量200～300 g，♀♂不限，具体分离方法见参照Wei等［5］。所有实验应在细胞分离后的12 h内完成。

1.3试剂亚硫酸钠(Na2SO3)，亚硫酸氢钠(NaHSO3)，牛磺酸(Tau)，L-谷氨酸(L-Glu)，牛血清蛋白(BSA)，HEPES，MgATP，CsCl，EGTA，EGCG 购 自 Sigma 公 司 (纯 度 ＞99.8%)，胶原酶P(Collagenase P)购自Roche公司，其它试剂均为国产分析纯。配制2 mol·L-1的NaHSO3和Na2SO3混合液(二者摩尔比为1∶3)、2 g·L-1EGCG的母液，实验前稀释到需要浓度。

1.4SOD、CAT、GPx活性的测定消化结束后，取分离完成的细胞悬液2 ml，先用10 μmol·L-1的亚硫酸盐染毒30 min，后分别加入 10、30、50 mg·L-1EGCG 处理 40 min。染毒结束后用超声波细胞破碎仪破碎细胞，于4℃ 4 000 r·min-1离心15 min。取上清液，测定总SOD，CAT，GPx的活性(按试剂盒说明书操作)。实验同时设对照和亚硫酸盐单独染毒各一组。

1.5·含量的测定同样取细胞破碎上清液，按照南京建成试剂盒测定H2O2，OH·及含量。

1.6 数据分析所有试验结果用±s表示，用one-way ANOVA检验进行统计分析。

2 结果

2.1 EGCG对SOD活性的影响10 μmol·L-1的亚硫酸盐明显降低了SOD的活性(12.69±0.14)U·ml-1，与对照相比(23.83±0.23)U·ml-1(P＜0.01)，差异有显著性。在加入10、30、50 mg·L-1的EGCG后，SOD活性随着EGCG浓度的增加逐渐回升，其含量分别为对照的63%，67%和86%。EGCG 50 mg·L-1时SOD活性与对照相比差异无显著性(P＞0.05)，但是与亚硫酸盐单独作用比较，差异有显著性(P＜0.05)。

2.2 EGCG对CAT活性的影响10 μmol·L-1亚硫酸盐降低了CAT活性至对照的69%(P＜0.05)。之后，心肌细胞用不同浓度的EGCG处理后，当EGCG浓度为30 mg·L-1时，CAT的活性仅仅被抑制了41%，该数值与亚硫酸盐单独作用比较差异有显著性(P＜0.05)，而当EGCG的处理浓度为50 mg·L-1，亚硫酸盐则未能抑制CAT的活性，即与对照相比差异无显著性(P＞0.05)，CAT活性为(1.09±0.48)U·mg-1Pro，为对照的76%，但与亚硫酸盐单独作用比较则差异有显著性(P＜0.01)。

2.3 EGCG对 GPx活性的影响GPx活性在10 μmol·L-1亚硫酸盐处理后与对照相比降低(P＜0.01)。然而，GPx活性随着EGCG浓度的增加而提高。在EGCG 30 mg·L-1时，GPx活性为对照的67%。在EGCG 50 mg·L-1处理中，GPx活性为26 U·ml-1，是对照的84%，但与亚硫酸盐单独作用比较，差异有显著性(P＞0.05)。

亚硫酸盐处理后，OH·和H2O2的累积量不断增加，分别为对照的1.53，1.40和2.13倍(P＜0.01)。在用EGCG处理后，亚硫酸盐诱导产生自由基受到抑制。在30 mg·L-1EGCG处理中，仅仅H2O2水平与对照相比仍有提高，而和 OH·的含量与对照相比无统计学意义。然而，所有结果与亚硫酸盐单独作用比较差异都有显著性(P＜0.05 or 0.01)，表明了EGCG抑制了亚硫酸盐诱导的自由基的产生。

3 讨论

亚硫酸盐可能通过食物、饮料和药物等进入体内，诱导产生含硫的自由基或过氧自由基，对各种器官及组织包括心脏造成一定的氧化损伤［6-7］。低浓度的EGCG就能起到抗氧化、抗炎症、抗肿瘤及抗癌作用，且对正常细胞的功能无明显的抑制作用。本研究主要探讨了EGCG对心血管系统的保护是否是通过抗氧化途径完成的。本研究结果表明，亚硫酸盐抑制了SOD，CAT和GPx的活性。当加入不同浓度的EGCG时，3种抗氧化酶的活性随着其浓度的增加而回升。为了证明以上结论，本研究测定了心肌细胞内的自由基水平，结果发现亚硫酸盐诱导了自由基的产生，而EGCG则抑制了这一作用。当EGCG浓度为30 mg·L-1时，亚硫酸盐的诱导作用不再明显。研究表明，EGCG的水溶液能够抑制脂质过氧化，清除体内的H2O2和自由基［8］，本研究结果与该观点是一致的。

综上所述，EGCG溶于水清除了体内过多的活性氧自由基保护了多种抗氧化酶，对亚硫酸盐诱导的心肌细胞的氧化损伤起到了一定的抑制作用。但有报道称EGCG在实验过程中存在自氧化现象，因此在今后的工作中还有待进一步研究。

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