胚胎干细胞的代谢组学方法在毒理学中的应用进展

周会芳，王 丽，张艳军，边育红

(天津中医药大学中药学院，天津市现代中药重点实验室，省部共建国家重点实验室培育基地，天津市中药化学及分析重点实验室，天津 300193)

毒理学是研究外源化合物对生物体损害作用的一门学科，随着科学技术的发展，新化学物质日益增多，传统的毒理学评价方法存在成本高，周期长，敏感度低等诸多不足。胚胎干细胞最早是由1981年Evans和Martin分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系，1998年美国威斯康星大学的Thomson和约翰斯霍普金斯医学中心的Gearhart成功的分离培养出人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cell，hESC)并在体外成功建系，使得胚胎干细胞再次成为研究的热点。

代谢组学是20世纪90年代后期发展起来的一门新兴学科，它是继基因组学，转录组学和蛋白质组学之后系统生物学的重要组成部分，它是英国Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的［1］，代谢组学通过考察生物体由病理生理刺激或遗传修饰引起的内源性代谢产物的变化，研究机体整体的生物学状况，它把人体作为一个完整的系统进行研究，重点考察人体等生物系统的内源性代谢物及其网络在疾病和毒物，药物作用下的变化规律，目前，代谢组学也是毒理学研究中的一种重要技术手段和有利工具，是当前毒理学研究领域中最活跃的研究热点［2］。本文主要就胚胎干细胞和代谢组学相关的实验技术及基于胚胎干细胞的代谢组学在毒理学中的应用现状进行了综述，并对其中存在的问题及发展趋势进行了初步探讨。

1 胚胎干细胞在毒性评价中的应用

1.1胚胎干细胞在毒性评价中的意义胚胎干细胞是一种存在于早期胚胎中的具有全能性细胞，可分化成三个胚层的细胞。由于它具有全能性，具有对药物作用反应迅速、敏感性高、干扰因素少等优点，根据胚胎干细胞特性而发展起来的胚胎干细胞试验(embryonic stem test，EST)可以从细胞毒性，分化抑制以及分子生物学水平反映发育毒性，因此胚胎干细胞可以作为一种重要的体外药物毒性评价工具［3］。

随着工业生产的发展，人工合成化学物质的种类不断增加，每年至少还有1000多种新的化学物质进入人类的生产和生活环境，对外源性化合物的危险性评价日益受到重视，目前急需能够确切反映外源性化合物对人体毒性作用的安全性评价模型。hESC来源于人类，能够真实反映人类细胞的生物特性，通过单一胚胎干细胞无限增殖和定向分化可以达到样本的高度标准化，并且通过建立不同种族或地区的人类胚胎干细胞载体能反映种族或地区间的生物特征差异。因此，应用hESC进行毒理学研究可以获得更直接的外源性化合物人体毒理学研究的资料［2］。

药物研发不仅周期长，投入大，而且风险高，一个新药从研发到上市大概需要历时10～15年，耗资近10亿美元。传统的药物安全性评价的方法是给予一定数量实验动物大剂量待测化合物，观察其毒性效应，然后将实验结果外推到暴露于小剂量相同化学物的大量人群，这种方法不仅试验周期长，而且从动物得到的数据很难外推到人。hESC作为一种体外毒性评价工具，具有快速、敏感、特异高、条件易控等优点，可以避免使用大批动物进行的长时间毒理研究，不仅可以节省动物及人力投入，还可缩短实验周期，增加实验的敏感性。于传统方法相比，不用考虑对人体及动物的副作用，更无需大量怀孕动物，一旦建系就可以获得源源不断的细胞用于研究，同时对细胞毒性而言，胚胎干细胞对药物等化合物的敏感性高于成体组织［4］。而且hESC作为良好的转染载体，能表达多种报告基因，能够满足研发早期高通量筛选的需求。

1.2胚胎干细胞在毒性评价中的应用将hESC应用于毒理学研究既可克服传统的体内和体外细胞毒性实验的不足，又可避免种属差异目前，hES已逐渐成为毒性筛选和毒理学机制研究必不可少的工具，其研究热点主要集中于寻找特异的检测终点和毒性效应标志物，进而建立和完善体外毒性评价模型。

1.2.1 发育毒物的体外筛选动物实验未发现沙利度胺明显的毒副作用，但1954年沙利度胺的上市，却在欧洲诞生了大量肢体缺陷的新生儿，这不仅揭示了动物和人对药物反映的差异，也揭示了药物体内筛选的局限性。EST是检测不同受试物对细胞增殖和分化的影响，通过受试物对hESC细胞的影响，对受试物影响个体发育的毒性和致畸能力进行判断［5］，不需要受孕动物，同时根据实验目的的需要，细胞分化为特定的组织细胞，通过对受试物的胚胎毒性进行高通量检测［6］，已成为哺乳动物发育毒性体外评价的代替方法。欧洲替代方法验证中心(the European Center for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)曾在大约360种受试物中，选出有明确胚胎毒性的受试物30种，使用EST进行胚胎发育毒性检测，结果表明，与在体实验结论的符合率达到82%，其中强胚胎毒性的符合率更达到100%［7］。展示了EST成为受试物胚胎毒性初筛方法的良好基础和应用前景。

1.2.2 靶器官毒性研究由于有些受试物胚胎毒性的产生，可能表现为较强的靶器官特异性，根据ESC的多能性，可以在不同的诱导条件下将其向特定组织器官的特定细胞分化，而且这种分化过程能反映受试物在整个细胞发育全过程的影响，利用这一特点可以对受试物可能作用的靶器官细胞及其方式和阶段进行初步判别［3］。

Nieden等［8］结合当前分子研究技术，发展了分子水平的EST，将受试物作用于分化的ESC，提取发育过程中第9天的的细胞RNA，进行RT-PCR分析，然后进行TaqMan PCR实时分析，研究肌球蛋白重链基因(Myosin Heavy Chain，MHC)的定量表达，MHC的调节性表达可能作为一种新的快速反应胚胎毒性的检测终点。

2 代谢组学在毒性评价中的应用

代谢组学是20世纪90年代后期发展起来的一门新兴学科，它是继基因组学，转录组学和蛋白质组学之后系统生物学的重要组成部分，它通过考察生物体由病理生理刺激和遗传修饰引起的内源性代谢产物的变化，研究机体整体的生物学状况。代谢组学在毒理评价中的应用主要是利用各种分析手段(高效液相色谱，High performance liquid chromatography ，HPLC、核磁共振，Nuclear Magnetic Resonance，NMR 和质谱，Mass Spectrum，MS等)定量检测生物样本(尿液，血浆，组织提取液等)中的内源性代谢产物，结合模式识别等化学技术对生物样本进行系统的测定和分析，比较生物体在不同状态下的代谢指纹图谱的差异，然后将这些代谢信息与生物体的病理生理变化联系起来，确定导致这些代谢改变的靶器官和作用位点，获得相关的生物标志物。

2.1 毒性作用机制的研究药物毒性作用机制是指机体接触药物开始至出现毒性损伤之间的一系列分子机制，例如毒物如何进入机体，如何与靶分子发生作用，如何产生其有害结果及机体的反应等，通过代谢图谱可对药物破坏正常细胞后引起的内源性代谢物的水平进行分析，从而研究其毒性作用机制，为准确评价药物毒性提供理论依据［9］。

2.2 药物临床前毒性评价药物临床前安全性评价的目的之一就是确定药物的毒性剂量范围，并作为药物的重要安全性能指标，与传统方法相比，利用代谢组学技术确定药物毒性剂量范围的准确率更高，并为临床合理用药提供理论依据。

Chen等［10］利用液 -质联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)结合气-质联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)的方法对雷公藤多糖成分在大鼠体内的毒性进行了研究，结果发现，当给药剂量达到100 mg·kg-1时发现氨基酸及胆碱水平升高等情况，而且波动并不明显，提示该药可能具有较高的安全剂量，很大程度上提高了该药的临床应用。Schoonen等［11］利用代谢组学的方法研究了对乙酰氨基酚在大鼠体内的毒性，对多个剂量的代谢物水平波动情况进行检测，至450 mg·kg-1时发现代谢物水平异常，由AST试剂盒证实该剂量下大鼠肝细胞出现坏死，故可将450 mg·kg-1定为药物毒性剂量，从而为临床安全用药提供依据。

因此，代谢组学作为一种实验操作和数据处理相结合的技术，能在灵敏度和特异性上满足药物临床前安全性评价的要求，而且在时间和效益上满足创新药物研发的需求。

2.3 确定毒物作用靶器官及特异性生物标志物生物标志物是指反映生物体系与环境因子的相互作用，并能客观测定和评价的某种特征性指标，可应用于疾病的诊断、防治和药物毒性的评价等。利用代谢组学研究代谢指纹图谱，可发现药物引起的内源性代谢物的变化，找到与药物毒 性相关的生物标志物，并作为药物毒性筛选的依据。

Boudonck等［12］应用代谢组学寻找大鼠体内肾毒性的早期生物标志物。大鼠给予已知肾毒性药物庆大霉素、顺铂和妥布霉素后，分别于1 d、5 d和28 d收集尿液和肾脏切片，通过气-质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS)，发现单次给予药物后，尿液中多胺类和氨基酸类含量升高，其时间要早于肾脏组织形态损伤和临床上常规的肾毒性化学指标。长期给药后，尿液中由肾毒性引起的氨基酸类物质的逐渐减少和肾脏组织中氨基酸类、核苷类物质的减少一致，而且和对照组比较，支链氨基酸水平和给药时间成正比。Chan和Cai［13］采用LC-MS方法研究大鼠给予马兜铃酸后尿液的代谢图谱，从中发现了犬尿烯酸和马尿酸两种可反映药物毒性的生物标志物，可作为评价马兜铃酸毒性的生物学指标。

3 基于胚胎干细胞的代谢组学方法在毒理学中的应用进展

近年来，各国学者对药物毒性评价方法做了比较系统和深入的研究，毒理学替代法研究在国外发展十分迅速，体外替代实验的研究手段将细胞、组织培养与基因组学，蛋白组学和代谢组学有机地结合在一起，并增加了计算机模拟辅助评价系统。自2000年7月ECVAM正式批准胚胎干细胞试验作为体外药物和化合物毒性筛选动物试验的替代方法，hESC在毒性评价中的应用受到广泛的关注;加之代谢组学能把人体等生物系统作为一个完整的系统进行研究，着重考察这些生物系统的内源性代谢物及其网络在疾病和毒性作用中的意义及药物作用下内源性代谢物的变化规律，基于hESC的代谢组学研究在毒理学研究中日益受到关注。

尽管胚胎干细胞能模拟胚胎的早期发育，被用多种人类疾病的体外模型，但有关胚胎干细胞产生的小分子物质的动态变化研究较少，在病理或化学药物作用下，小分子代谢物如糖，有机酸，氨基酸和脂肪酸参与了细胞应答的功能机制，这些小分子代谢物可以作为疾病和毒性反应的候选生物标志物。代谢组学利用核磁共振(NMR)或者质谱技术可以对小分子代谢产物进行准确的检测。利用胚胎干细胞和代谢组学技术的结合来评价发育毒性是由威斯康辛大学的Cezar等［14］首次提出，并进行了较深的研究，采用一种已知的神经发育毒性药物丙戊酸盐作用于胚胎干细胞和胚胎干细胞来源的神经前体细胞，收集细胞上清液进行LC-MS检测及分析，结果表明，色氨酸代谢的中间产物犬尿素(3-氨茴酰丙氨酸)和谷氨酸代谢产生的小分子代谢产物的含量有显著的升高，并通过RT-PCR进行了验证，提出犬尿素(3-氨茴酰丙氨酸)及其代谢产物可以作为癫痫药物发育毒性的候选生物标志物，胚胎干细胞蜕变中间产物可能作为预知和检测药物疗效和毒性反应的生物标志物。

Paul等［15］利用胚胎干细胞和代谢组学相结合的方法来预测药物的发育毒性。采用LC-MS的分析方法来检测几种有明确致畸性药物刺激ESC后产生的小分子物质含量的变化，这些小分子可以作为发育毒性的生物标志物，能更加敏感的预测药物的致畸性。除此之外，这种模型在后来的对维生素A和碘胺酮等八种药物进行盲法试验中，能准确预测到七种药物是否有致畸性。所以利用ESC和代谢组学的方法去寻找发育毒性的生物标志物，这可以作为一种体外评价发育毒性的新思路。

4 展望

近年来，国内外有关中草药不良反应的报道日见增多，在一定程度制约了中医药事业的现代化和国际化进程，但目前尚无中药毒性作用评价的统一标准及客观依据。如何制定一套快速、准确、客观、敏感的中药安全性评价体系是当前中药安全性评价亟待解决的问题之一。

将代谢组学研究方法应用于胚胎干细胞进行毒理评价，考察药物在接近常态状况下对胚胎干细胞影响的生物学过程，考察毒性药物作用前后胚胎干细胞的代谢物图谱变化，通过与毒性靶器官细胞和整体动物实验代谢组学毒性标志物进行对比分析，确定其关联性，找出基于胚胎干细胞代谢组学毒性标志物，发现一个或一组毒性作用的分子标记物，并初步确定该(组)毒性标志物的毒效范围，进而应用于毒理作用评价，为今后中药毒性评价提供快速、敏感、可靠的毒性标志物。从而为中药安全性评价开辟一条全新的研究思路，并建立一套快速、敏感、高效的评价方法。

［1］Nicholson J K，Lindon J C，Holmes E.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data［J］.Xenobiotica，1999，29(11):1181-9.

［2］彭双清，郝卫东，伍一军.毒理学替代法［M］.北京:军事医学科学出版社，2008:499，438-541.

［2］Peng S Q，Hao W D，Wu Y J.Toxicology substitution［M］.Beijing:Press of Military Medical Sciences，2008:499，438-541.

［3］Davila J C，Cezar G G，Thiede M.Use and application of stem cells in toxicology［J］.Toxicol Sci，2004，79(2):214-23.

［4］Eisenbrand G，Pool-Zobel B，Baker V，et al.Methods ofin vitrotoxicology［J］.Food Chem Toxicol，2002，40(2-3):193-236.

［5］于 洲，徐海滨.胚胎干细胞试验及其在毒理学发育毒性安全性评价中的应用［J］.中国食品卫生杂志，2006，3(18):247-9.

［5］Yu Z，Xu H B.Embryonic stem cell test and its application in safety evaluation of development toxicity［J］.Chin J Food Hyg，2006，3(18):247-9.

［6］Schwengberg S，Bohlen H，Kleinsasser K.In vitroembryotoxicity assessment with dental restorative materials［J］.J Dent，2005，33(1):49-55.

［7］Scholz G，Pohl I，Genschow E.Embryotoxicity screening using embryonic stem cellin vitro:correlation toin vivoteratogenicity［J］.Cells Tissues Organs，1999，165(3-4):203-11.

［8］Zur Nieden N I，Ruf L J，Kempka G，et al.Molecular markers in embryonic stem cells［J］.Toxicol In Vitro，2001，15(4-5):455.

［9］Clarke C J，Haselden J N.Metabolic profiling as a tool for understanding mechanisms of toxicity［J］.Toxicol Pathol，2008，36:140-7.

［10］Chen M J，Ni Y，Duan H Q，et al.Mass spectrometry-based metabolic prefiling of rat urine associated with general toxicity induced by the multiglycoside of tripterygium wilfordii hook.f［J］.Chem Res Toxicol，2008，21:288-94.

［11］Schoonen W，Kloks C，Ploemen J，et al.Sensitivity of 1H NMR A-nalysis of rat urine in relation to toxicometabonomics［J］.Toxicol Sci，2007，98(1):271-85.

［12］Boudonck K J，Mitchell M W，Német L，et al.Discovery of metabolomics biomarkers for early detection of nephrotoxicity［J］.Toxicol Pathol，2009，37:280-92.

［13］Chan W，Cai Z W.Aristolochic acid induced changes in the metabolic profile of rat urine［J］.Pharmaceut Biomed，2008，46:757-62.

［14］Cezar G G，Quam J A，Smith A M，et al.Identification of small molecules from human embryonic stem cells using metabolomics［J］.Stem Cells Dev，2007，16(6):869-82.

［15］West P R，Weir A M，Smith A M，et al，Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics［J］.Toxicol Appl Pharmacolm，2010，247(1):18-27.