神经生长因子对哮喘大鼠气道炎症中TNF-α表达的调节作用

佘巍巍 陈 峰 罗 淼 (桂林医学院附属医院呼吸内科，广西 桂林 541001)

哮喘是多种炎性细胞、炎症介质参与的慢性气道炎症性疾病，哮喘的发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明。神经生长因子(NGF)不仅作用于神经系统，也影响机体免疫和造血系统，与变态反应性和炎症性疾病的发病有关。近年来研究发现哮喘及其他许多致敏性疾病的发病可能与NGF直接相关〔1，2〕，目前已在支气管哮喘的动物模型上证实NGF在哮喘炎症的发生发展和维持中起着重要的作用〔3〕。本研究通过检测各组大鼠肺组织内NGF、嗜酸性粒细胞及TNF-α的表达量的变化，判断NGF是否通过调节TNF表达参与哮喘发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 清洁级雌性SD大鼠，非卵蛋白饲养，按随机数字表法将小鼠随机分为分为对照组(A组)、哮喘组(B组)和 NGF阻断组(C组)，每组10只。鸡卵清蛋白(OVA，V级，由美国Sigma公司提供)，抗-NGF抗体(由武汉博士德生物有限公司提供)。

1.2 动物制模 A组:致敏过程以PBS代替OVA注射，激发过程以盐水雾化吸入，相关参数与B组相同;B组哮喘模型的构建方法于实验第1、第14天致敏，即卵白蛋白20 μg由1 mg氢氧化铝乳化，总体积200 μl，腹腔注射。第21～27天，将大鼠置于密闭容器内，以超声雾化器雾化3%OVA盐水气溶胶吸入激发，每天1次，每次30 min。C组哮喘模型建立同哮喘组，但于每次激发前3 h，先经鼻滴入抗大鼠β-NGF抗体(稀释1∶50)50 μl，每日 1 次，连续 7 d。

1.3 各组大鼠哮喘发作情况观察与评分 最后一次激发后5 min，采用评分法比较各组动物在激发后的反应情况:无发作者计0分;仅出现轻度呼吸急促，无躁动不安和发绀者计1分;明显呼吸急促、躁动不安和发绀者计2分;呼吸极度困难，并出现俯伏不动、反应迟钝者计3分。

1.4 支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数 大鼠末次激发后24 h麻醉，结扎右肺，从气管注入无菌磷酸盐生理盐水缓冲液4 ml灌洗左肺，反复6次，回收率50% ～90%，将收集到的全部支气管肺泡灌洗液离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液置于－20℃低温冰箱保存，高倍镜下计数400个细胞行细胞分类计数。

1.5 支气管肺组织病理检测〔4〕灌洗后经气管向右肺注4%多聚甲醛使胸膜展平后，置4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，厚度约5 μm，HE染色，显微镜下观察支气管肺组织病理特征。

1.6 免疫组织化学 石蜡切片经常规处理后，原位分子杂交，石蜡切片经常规处理后，按经典方法进行原位分子杂交。阴性对照用PBS代替上述抗体。原位杂交比较三组TNF-α水平，RT-PCR半定量法测定哮喘大鼠组及正常对照组肺组织NGF mRNA表达，Western印迹法检测三组NGF蛋白水平变化;观察NGF、TNF-α及其mRNA在肺组织的表达，并用显微图像分析系统测定8个视野的阳性系数和灰度值。NGF、TNF-α及其mRNA阳性细胞均以胞质着色为主，阳性颗粒呈棕褐色或棕黄色。

1.7 统计学处理 所有统计数据用SPSS 13.0统计软件处理。数据以表示，多样本均数比较采用F检验。相关性检验采用Pearson直线相关分析。

2 结果

2.1哮喘大鼠哮喘发作分析 哮喘组大鼠发作评分与正常对照组差异显著(P＜0.05);NGF阻断组大鼠发作评分低于哮喘组(P＜0.05);NGF阻断组大鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞数明显低于哮喘组(P＜0.05);哮喘组及NGF阻断组大鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞数均明显高于正常对照组(P＜0.05)。按哮喘大鼠的发作程度行等级相关研究，随哮喘大鼠临床发作越重，嗜酸粒细胞数越，两者呈正相关。

2.2 NGF蛋白及NGF-mRNA的表达与TNF-α蛋白及TNF-α mRNA的表达 哮喘组大鼠肺组织NGF蛋白、NGF mRNA的平均灰度值分别为145±7、128±7;对照组分别为189±7、191±6;抗NGF干预组分别为156±6、139±8;三组比较差异显著(t=19.50、15.90、14.89，均 P ＜0.05);而哮喘组大鼠TNF-α 蛋白及TNF-α mRNA 的灰度值分别为141±7、127±7，对照组分别为175±8、179±9，抗NGF干预组分别为164±8、155 ±6，三组差异显著(t=28.40、21.75、22.22，均 P ＜0.01)。各组大鼠肺组织NGF蛋白平均阳性系数为:B组＞A组，C组 ＜B组(t=1.29、3.85、2.19，均 P ＜0.05);其阳性产物平均灰度值(待测物质灰度值越高，表明其在细胞中表达的量越低，反之，灰度值越低表明其在细胞中表达的量越高，下同)，其NGF mRNA平均阳性系数为:B组＜A组，C组＞B组(t=1.24、3.65、2.14，均 P ＜0.05)。各组大鼠肺组织中 TNF-α 蛋白平均阳性系数为:B组＞A组，C组＜B组(t=1.61、3.80、2.35，均P＜0.01);其 TNF-α mRNA平均灰度值为:B组 ＞A组，C组 ＜B 组(t=1.47、3.81、2.19，均 P ＜0.01)。NGF 阻断组其肺组织TNF-α的水平低于哮喘组肺组织TNF-α的水平(P＜0.05)。NGF阻断组其肺组织NGF的水平低于哮喘组NGF的水平(P＜0.05)。按哮喘大鼠的发作程度行等级相关研究，随哮喘大鼠临床发作越重，NGF水平越高，两者正相关。

3 讨论

近年的研究发现，NGF是神经源性炎症反应的重要介质〔5〕，通过连接神经系统和免疫系统而发挥放大气道炎症的作用。除了免疫源性机制外，气道炎症的神经源性因素日益受到重视。在本研究中，哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的NGF含量与气道炎性指标嗜酸性粒细胞密切相关，表现为BALF中NGF含量越多，嗜酸性粒细胞浸润数越多。在用抗NGF抗体处理过的大鼠气道内，嗜酸性粒细胞明显减少。这说明NGF促进嗜酸粒细胞在气道内的浸润，说明NGF可以促进气道炎症发展。这与国外文献相符〔6〕，在哮喘病人血清和BALF液中NGF的水平亦明显升高。

本研究显示在哮喘发病过程中，NGF参与了发病过程。与国外实验证明哮喘状态下NGF及其受体表达升高〔7，8〕相符，在本研究中行等级相关研究，我们进一步证实哮喘大鼠临床发作越重，NGF水平越高，两者呈正相关，表明检测NGF有助于哮喘的临床诊断和病情评估，并可能有助于判断哮喘的发展与预后。本研究提示哮喘大鼠肺组织NGF水平高于NGF阻断组，与国外报道一致。De-Vries等〔9〕报道给豚鼠静脉注射NGF半小时后，便可诱发豚鼠气道对组胺的高反应性，气道阻力明显增高，而NGF本身并不引起气道阻力的改变。若用抗NGF抗体拮抗NGF，则能消除NGF引起的气道功能改变，以上证据表明NGF可能是连接气道炎症和气道高反应性的一架桥梁。

因国内外资料〔10，11〕均已证实TNF-α对气道炎症具有促进作用，哮喘组大鼠血清、BALF中的TNF-α浓度较正常对照组增高，通过趋化激活中性粒细胞等炎性细胞共同参与气道炎症的形成，在气道炎症的持续和放大中起到重要放大作用，说明其在气道炎症发病中具有重要意义。本实验表明拮抗NGF生物活性则能够有效抑制TNF-α的合成和分泌。我们判断哮喘大鼠发作时可能系由肺组织TNF-α mRNA表达增加，TNF-α生成增多所致，阻断内源性NGF可降低哮喘大鼠肺组织TNF-α mRNA的表达，NGF可通过调节TNF的表达而促进气道神经源性炎症过程，提示NGF可能通过调节TNF-α的表达参与哮喘发病，这从分子生物学的角度进一步说明了NGF及TNF与哮喘气道炎症的发生密切相关，NGF可能通过增进肺组织TNF-α mRNA的表达作为参与哮喘的发病机制之一。以上结果提示NGF是调控神经源性炎症的关键性细胞因子，通过连接神经系统和免疫系统发挥放大气道炎症的作用，为进一步阐明哮喘气道神经源性的机制奠定基础，为哮喘的预防和治疗提供新的可能途径。

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