胰腺癌血清Periostin水平与淋巴结转移的关系

刘 宇 刘保安 (中南大学湘雅基础医学院病理学系，湖南 长沙 410078)

胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，多发生于胰头部。腹痛及无痛性黄疸为胰头癌的常见症状。癌肿转移在早期即可出现，对于胰腺癌临床又缺乏早期诊断的有力手段，采用手术切除方式只有10%～15%的病人在确诊后可以根治性切除，况且肿瘤患者5年存活率也只有5% ～20%〔1〕。胰腺癌淋巴结转移对于手术治疗和预后是至关重要的因素。近年来发现，Periostin(PN)的过表达与肿瘤的恶性程度、侵袭性和转移性有密切关系〔2，3〕。本文将利用ELISA技术探讨胰腺癌血清PN水平与淋巴结转移的相关性。

1 资料与方法

1.1 试剂与设备 人PN重组蛋白、兔抗人PN mAb、兔抗人PN pcAb、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(IgG-HRP)和牛血清白蛋白(BSA)(R＆D 公司)，3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(上海江莱生物科技有限公司)。雷勃MK3 Multiskan酶标仪、THERMO Wellwash 4 MK2全自动洗板机(Thermo公司，芬兰)。

1.2 标本采集 所有受试者均根据诊断标准进行确诊，并分组处理，诊断依据:(1)临床表现为腹痛、黄疸和消瘦;(2)实验室检查:①一般血清生化学检查;②胰腺癌血清学标记物免疫学检查:具体包括:糖链抗原19-9(CA19-9)，癌胚抗原(CEA)，胰胚抗原(POA)、胰腺癌特异抗原(PaA)及胰腺癌相关抗原(PCAA)检测指标;③影像学检查:B超、CT、磁共振成像(MRI)进行胰腺癌普查、筛选、诊断、确诊，以供分组。检查结果其中健康成人31例(自愿健康体检者)，胰腺癌患者18例和有远处转移的胰腺癌患者18例，采集67例受试者的血清样本，收集血清后，迅速离心10 min，－20℃保存备用。

1.3 ELISA方法

1.3.1 操作 首先采用棋盘滴定法确定最佳浓度，结果表明:在包被抗体浓度1.0 μg/ml，检测抗体浓度1∶1 000比例时，标准曲线线性关系佳。具体操作:(1)将兔抗人PN mAb稀释1∶1 000后，包被酶标板，在4℃中，包被48 h，用3%BSA 进行封闭;(2)在37℃温度下，加入1%磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的人PN重组蛋白标准品使其作用1 h;(3)再加入经1%PBS稀释的1∶1 000 PN pcAb，4℃环境过夜，然后再放置室温1 h;(4)加入经1%PBS稀释的1∶1 500羊抗兔IgG-HRP，37℃恒温箱显色15 ～30 min 后，读记吸光度 A450 值〔3，4〕。

1.3.2 鉴定检测与PN检测分析 先以兔抗人PN mAb包被酶标板，分别加入白介素6(IL-6)、血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)、生长激素(GH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)，测定A450值并与阴性对照比较。如果PN测值为0或很低，提示血清中IL-6、VCAM-1、GH和ACTH抗原对PN的检测影响很小，试剂盒的特异度较强〔4，5〕。PN ELISA 试剂盒分别测定 31例健康成人，18例胰腺癌患者和18例有淋巴结转移的胰腺癌患者的血清PN，以PN蛋白浓度为横座标，以A450平均值为纵座标，绘制标准曲线。标准曲线由分析软件处理。

1.4 统计学分析 采用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，采用t检验。

2 结果

2.1 标准曲线灵敏度和特异性评价 取3份已知浓度的标准品，进行批内和批间变异系数分析。分析结果显示:试剂盒的试验内变异系数平均为7.6%，均小于10%;试验间变异系数平均为13.15%，均小于15%。在不同PN浓度的PN蛋白标准液，用已建立的ELISA方法测得的回收率在82% ～92%之间，平均回收率为89.6%。标准曲线方程式曲线拟合度R2=0.968。线 性 范 围 为 4.903～500 ng/ml。灵 敏 度 为4.903 ng/ml。在加入 IL-6、VCAM-1、GH 和 ACTH 后测 A450值，与阴性对照孔的A450值比较，无显著性差异，无统计学意义(P＞0.05)，提示PN蛋白与这些物质均无交叉反应，试剂盒的特异度较强。

2.2 检测结果 健康对照者31例的血清PN含量为(22.0±6.8)ng/ml，分布呈正态，以血清浓度＜35.60 ng/ml为正常界值。18例胰腺癌患者的血清PN含量为(37.9±20.9)ng/ml，18例有淋巴结转移的胰腺癌患者的血清PN含量为(45.6±25.8)ng/ml。胰腺癌患者与健康对照者间差异具有统计学意义(P＜0.05)。而18例胰腺癌患者与健康对照者和18例有淋巴结转移的胰腺癌患者之间均有显著性差异(P＜0.05)。

3 讨论

PN过表达与恶性肿瘤恶性程度相关，PN与整合素结合并相互作用参与肿瘤发展，同时通过整合素和(或)EGF信号途径促进癌细胞侵袭转移。有研究表明，PN在促进癌细胞生存中起重要作用，并提出了其抗体可能是有效的治疗药物的假设。PN在肿瘤血管生成、转移瘤生长中起关键作用〔6，7〕。

由于肿瘤转移容易导致抗癌治疗失败和患者死亡〔8〕，而转移相关基因被认为是早期预测恶性肿瘤生物学行为的关键。大量研究发现，PN基因就是肿瘤转移候选基因之一，具有促进晚期肿瘤进展的作用;PN蛋白过表达与肿瘤转移和预后不良具有很好的相关性〔9〕。然而胰腺癌肿瘤诱导PN细胞因子的分子机制尚不明确，PN如何促进癌细胞生长和生存机制也尚需进一步研究。可是，本文实验研究发现，胰腺癌患者的PN蛋白水平明显高于健康正常人，而有淋巴结转移的胰腺癌患者其PN蛋白水平明显高于胰腺癌患者，这些都证实了PN与肿瘤转移有密切关系。因此，PN蛋白水平的检测可以用于判断胰腺癌和作为诊断胰腺癌是否出现淋巴结转移的指标。

1 Stojadinovic A，Brooks A，Hoos A，et al.An evidence-based approach to the surgical management of resectable pancreatic adenocarcinoma〔J〕.J Am Coll Surg，2003;196(6):954-64.

2 王 强，傅德良.胰腺癌淋巴结转移研究进展〔J〕.中国实用外科杂志，2009;8:682-5.

3 贲其稳，袁耀宗.Periostin在恶性肿瘤中的作用研究进展〔J〕.肿瘤防治研究，2009;36(5):440-2.

4 贲其稳，赵 缜，周 琳，等.检测骨膜素ELISA试剂盒的制备与初步应用〔J〕.现代免疫学，2009;1:64-7.

5 魏国兰，丁 妍，韩宇翔，等.杨子义抗环瓜氨酸肽抗体定量检测ELISA试剂盒的制备及其诊断类风湿性关节炎的意义〔J〕.中国生物制品学杂志，2008;21(5):421-4.

6 陈鑫磊，秦泽莲.Periostin促进血管形成的机制〔J〕.医学综述，2011;17(2):161-3.

7 高 峰，孙治君.血管内皮生长因子-C与胰腺癌淋巴管生成及淋巴结转移关系研究进展〔J〕.重庆医学，2010;39(5):608-11.

8 樊 洁，唐 峰，李 琼，等.胰腺癌淋巴结转移与P53、Ki67表达及预后的关系〔J〕.中国临床医学，2007;14(6):825-8.

9 Siriwardena BS，Kudo Y，Ogawa I，et al.Periostin is frequently overexpressed and enhances invasion and angiogenesis in oral cancer〔J〕.Br J Cancer，2006;95(10):1396-403.