中药有效成分半抗原抗体制备技术的研究进展

廖国平， 汪 艳， 陈莉婧， 张忠义

(南方医科大学珠江医院药剂科，广东广州 510282)

随着免疫分析技术的不断发展，人们对一些微量的小分子活性物质进行痕量分析，利用它们具备反应原性的特点制备特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，采用免疫学分析手段进行检测。这些免疫分析方法凭借其特异性强、灵敏度高、检测迅速、样本通量大、成本低廉的特点，在食物过敏、农药残留分析、抗生素残留分析、中药有效成分研究等领域有着广泛的应用。抗体作为各种免疫分析的核心试剂，对免疫分析方法的灵敏度、特异性等起着至关重要的作用。因此，高亲和力抗体的制备是免疫分析技术发展的关键。

大多数中药有效成分是小分子物质，如有机酸类、黄酮类、木脂素类、皂苷类和萜类等，其中一部分只有反应原性而不具有免疫原性，属于半抗原。由于分子量太小，半抗原结构中含有较少的抗原表位，不能刺激机体产生抗体，故必须和特定的高分子量的蛋白类或多肽结合，形成半抗原-载体复合物(完全抗原)，经动物免疫程序才能制备针对半抗原的特异性抗体。

近年来，国内外科研人员在中药有效成分半抗原的抗体制备这一领域做了大量的探索和研究，并开始将中药有效成分半抗原抗体应用到中药现代化领域。本文主要对近年来中药有效成分半抗原的抗体制备过程中的研究情况作一综述。

1 中药半抗原的结构特点

中药有效成分半抗原大多是小分子碳水化合物，其分子结构复杂，作者将其大致分为有机酸类、黄酮类、木脂素类、皂苷类、萜类等几类进行分析:

1.1 有机酸类 有机酸类(不包括氨基酸)是分子结构中含有羧基的一类化合物，而羧基易与载体上的氨基偶联形成完全抗原。有人利用绿原酸［1］、阿魏酸［2］等有机酸结构中的羧基与载体偶联制备了完全抗原。

1.2 黄酮类 黄酮类是一类具有三环苯基苯并吡喃结构的呈色化合物，其母核上常有羟基、甲氧基等取代基，而羟基的酸性较强，可以先形成混合酸酐再与载体上的氨基偶联形成完全抗原。法国波尔多大学Bennetau B等人利用混合酸酐法将橙皮苷［3］、芒丙花黄素、黄豆苷元和染料木黄酮［4］等黄酮类半抗原在三丁胺的存在下与氯甲酸异丁酯反应形成混合酸酐，再与BSA上的伯胺基偶联形成完全抗原，最终免疫新西兰兔制备了一系列多克隆抗体。

1.3 木脂素类 木脂素类多数是由二分子C6-C3单体缩合而成的化合物，而组成木脂素的C6-C3单体主要是对羟基桂皮醇、松柏醇和芥子醇等，因而在木脂素的苯核4位上有羟基存在，可以与氮化修饰的载体偶联制备完全抗原。日本名古屋大学Nagasaki T等人利用重氮化法将Agatharesinol［5］与重氮化修饰的BSA偶联形成偶联比高达27的完全抗原。

1.4 皂苷类 皂苷类多数由多分子糖或糖醛酸与苷元组成，而糖基可以被高碘酸钠法氧化成双醛、糖醛酸中含有羧基，因而适合与载体偶联制备完全抗原。日本福冈大学Shoyama Y等人利用高碘酸钠法将柴胡皂苷类［6］、甘草皂苷［7］、人参皂苷 Re［8］等皂苷类半抗原与载体偶联制备完全抗原，然后利用聚乙二醇法(PEG)制备了一系列单克隆抗体。

1.5 萜类 萜类是概括所有异戊二烯的聚合物以及它们衍生物的总称，而衍生物大多以醇、醛、酮、羧酸、酯类以及苷类等多种形式存在，因而易与载体偶联制备完全抗原。有人成功制备了紫杉醇［9］、柠檬苦素［10］等萜类的完全抗原。

2 载体和佐剂的使用

中药有效成分半抗原无免疫原性，通常需要与大分子载体偶联制备完全抗原才能诱生抗体。完全抗原在机体的免疫应答过程中，载体部分可诱使免疫系统产生新的T细胞表位(epitope)，半抗原部分可诱使免疫系统产生新的B细胞表位，因而完全抗原能够被抗原递呈细胞(APC)识别与捕获，与组织性复合物分子(MHC)结合形成复合物，进而将T细胞表位递呈给相应的T细胞克隆并使之活化，在活化的T细胞辅助下，结合了新B细胞表位的B细胞对完全抗原进行克隆活化、分裂、增殖，并分泌针对新B细胞表位的抗体［11］。自从1945年Landsteinen首次将小分子半抗原偶联到载体上诱生出抗体以来，至今利用这种技术已制备了上百种小分子的抗体。

制备完全抗原需要有合适的载体，而理想的载体分子应该具有:(1)强免疫原性;(2)大量可与半抗原结合的功能性基团;(3)较好的溶解度(即使衍生化后仍然能保持较好的溶解度);(4)体内无毒性［12］。由于蛋白质结构中含有大量功能性基团，免疫原性好，不仅可以增加半抗原的分子量，还能对半抗原产生载体效应，故现在一般选用各种蛋白质作为大分子载体。常见的蛋白质载体有牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)、肌红蛋白(myoglobin)等。目前，用得最多的是牛血清白蛋白(BSA)，因为其理化性质稳定、不易变性、价廉易得，而且赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的pH和离子强度下均有较好的溶解度，在含有机溶剂(如DMF)的情况下仍可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态［4］。

近年来，阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)开始进入科研工作者的视野，cBSA是通过化学反应用带正电荷的氨基取代BSA中的带负电荷的羧基而成，与细胞膜上带负电荷的抗原提呈细胞(APC)有极好的亲和性，因而能加快机体免疫应答速度，增加免疫应答的程度并在体内持续较长的时间，产生高效价的抗体［13］。有文献报道，由于cBSA表面高阳离子化(pI＞11)，相同剂量下的cBSA诱导T细胞增殖的程度明显高于 BSA［14］。

由于完全抗原的量通常极少，免疫动物过程中必须使用佐剂。采用佐剂可以起到缓释免疫抗原的作用以增加对动物的局部刺激，同时还能增强局部淋巴结的炎症反应［15］。理想的佐剂应该能够激发多种实验动物维持较高的抗体滴度，并可用于绝大多数抗原，易制备，便于注射，免疫毒性低且对研究者无危害。遗憾的是目前尚无完全符合上述标准的佐剂，可用于抗体制备的各类佐剂主要包括油乳剂、矿物盐类、皂苷类、微生物产品、人工合成品以及混合产物的佐剂。油包水型乳剂，如弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)，在抗体制备领域应用最广泛、易得、刺激性小、产生较少的炎性产物，但是仍可能引起实验动物的大量副作用［16］。铝佐剂以氢氧化铝、硫酸铝或磷酸铝水合凝胶的形式从抗原溶液中强烈吸附抗原，形成沉淀，当其注射到机体内后形成一个“抗原库”，缓慢释放出抗原，充分延长了抗原的作用时间;同时还能显著地降低抗原用量和加强免疫应答;最引人注意的是，在进行首免后，再免时可以不用佐剂［17］。众所周知，铝佐剂可能在注射部位形成瘙痒结节，包括无菌性脓肿、红斑、皮下结节、肉芽肿炎症和接触性超敏反应，而纳米铝技术已为解决该问题提供了可能性［18］。

3 半抗原与载体的偶联

在制备完全抗原时，半抗原是通过一个“桥”(偶联剂)与载体偶联。桥结构可以防止大分子载体对半抗原的屏蔽作用，即防止半抗原与载体结合时被包埋在卷曲凹陷的蛋白质结构中，从而更易被B细胞识别。4-6个碳原子的间隔对于抗原抗体反应已足够，研究表明半琥珀酸盐(4个碳原子的桥)可产生最大的免疫反应［19］。Maiken 等［12］对 7.2NY(肽链半抗原)的抗体研究发现，偶联比、偶联位点对产生的特异性抗体的亲和力、滴度有很大影响。

理想的偶联方法应该能:(1)与半抗原以特定的化学结构100%偶联，产物的组成均一;(2)产生稳定的偶联，重复性好;(3)偶联的操作简单，不影响生物活性;(4)经济易得。但是目前为止没有一种偶联方法能够完全满足上述要求，并且不同方法的偶联效率有较大差距。目前常见的偶联方法主要有以下几种:

3.1 碳二亚胺法 碳二亚胺(EDC)使羧基与氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物，然后再与载体上的氨基偶联形成完全抗原。白花丹素［20］、柚皮苷［21］等均可在水溶性碳二亚胺的作用下溶解，与蛋白载体偶联制备完全抗原。

3.2 半琥珀酸盐法 某些带有羟基的半抗原可与琥珀酸酐反应形成带羧基的化合物，再与载体上的氨基偶联形成完全抗原。莪术醇［22］完全抗原即用莪术醇先与琥珀酸酐反应形成莪术醇丁二酸单酯，再与BSA偶联制备而得。雷公藤内酯醇［23］完全抗原即在弱碱性环境下，用琥珀酸酐对雷公藤内酯的14位羟基进行衍生化修饰形成带羧基的莪术醇丁二酸单酯，再以碳二亚胺做偶联剂与cBSA偶联制备而得。

3.3 高碘酸钠法 某些带糖基的半抗原可以通过高碘酸钠的氧化作用形成带双醛基的化合物，再与载体表面的氨基偶联形成含Schiff碱的共价结构的完全抗原。番泻苷［24］、马兜铃酸 II［25］、紫杉醇［26］等均是在高碘酸钠氧化后再与 BSA 偶联制备完全抗原。芍药苷［27］的完全抗原即在高碘酸钠氧化后与HSA偶联制备而成。但此偶联方法易破坏半抗原中的某些亲水基团，并使该基团在完全抗原中表现为疏水基团，疏水基团因为疏水相互作用性被载体蛋白包裹至内部而不能直接和B细胞的表面接触，最终不能刺激B细胞产生相应的抗体［28-29］。

3.4 混合酸酐法 含有羧基或酚羟基的半抗原可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，生产活性中间体混合酸酐，再与蛋白载体上的伯胺基反应，形成酰胺交联键。橙皮苷［3］、芒丙花黄素、黄豆苷元和染料木黄酮［4］的完全抗原即在三丁胺的存在下与氯甲酸异丁酯反应形成混合酸酐，再与BSA上的伯胺基偶联而成。

3.5 重氮化法 含有芳香胺的半抗原也可通过与亚硝酸反应形成重氮盐，再与蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基、组氨酸残基上的咪唑环或色氨酸残基的吲哚环反应。该偶联方法可以通过重氮化后颜色的变化(红棕色)判断是否偶联成功。但该方法重氮化连接键不稳定、副反应严重，可能引起蛋白大量的沉淀，需特别注意。Nagasaki［5］等人将该方法灵活应用到去甲木脂素的完全抗原制备，首先将对氨基马尿酸(pAHA)取代BSA上的赖氨酸残基形成芳香胺基团，修饰后的BSA再经过重氮化后与agatharesinol上的活性氢偶联形成完全抗原。

3.6 曼尼希法 对于不含常见功能性基团的而含活性氢的半抗原通常选用重氮化法和曼尼希法，曼尼希法利用cBSA载体与甲醛脱水交联，然后再与半抗原上的活性氢偶联形成完全抗原;而且曼尼希法则可以形成稳定的共价结构、副反应较少、偶联效率高、适用面广，有较大的应用前景，但该方法禁用于含胺基的半抗原的完全抗原制备，以防半抗原自身聚合对反应产生干扰［13］。

上述这些偶联方法同样适用于抗体导向药物的研究，所不同之处在于半抗原连接的蛋白是免疫球蛋白，含有大量的氨基、羧基等功能性基团，同时偶联应尽量避开抗原结合区防止抗体活性受影响。

4 完全抗原的纯化及鉴定

半抗原与载体偶联后所得的完全抗原必须进行纯化以除去未反应的半抗原、交联剂、盐类及其它小分子杂质。完全抗原的纯化对其自身的鉴定及产生高质量的抗体都是十分重要的。目前最常用的纯化方法是透析和排阻层析脱盐。透析所需时间一般较长(通常需3 d以上)，但纯化较为彻底、操作相对简单。将偶联后的反应体系装入适宜孔径的透析袋中，然后放入透析液(常用PBS缓冲液、碳酸盐缓冲液、生理盐水、去离子水等)中即可，定时更换透析液，以透析外液中检测不出小分子为止。排阻层析常用的介质有葡聚糖凝胶、纤维素及聚丙烯酰胺凝胶等，脱盐所需时间较短(通常仅需10 min以内)，通常分子量较大的完全抗原较早流出，易与分子量小的物质分离，但操作相对复杂，需要对流出组分进行跟踪分析，进一步确定目标组分。

经纯化后的完全抗原必须经过鉴定，才能初步判断半抗原与载体是否偶联成功以及定量分析其偶联比。目前完全抗原鉴定的常见方法主要有以下几种:

4.1 紫外扫描法 在紫外区有吸收的半抗原，首先可以将偶联物紫外光谱的最大吸收波长与原载体和半抗原进行比较，判断是否偶联成功［30］，然后根据吸收度的加和性原理，分别测定半抗原、载体、偶联物在吸收峰处吸收度，计算其摩尔吸光系数(e)根据公式:偶联比 =(e偶联物－ e载体)/e半抗原计算。该方法应用范围广、分析成本低、操作简单、快速，但是对于无紫外吸收的半抗原难以进行鉴别。

4.2 红外光谱法 将偶联物、载体、半抗原等与KBr压片后进行红外检测，通过分析各红外光谱图中各特征波数区域吸收峰变化，初步判定偶联是否成功［31］。该方法应用范围广、特征性强、提供信息多，因而能够初步解释偶联反应机理，但定量分析时误差大，灵敏度低，故很少用于定量分析。

4.3 基质辅助激光解吸附质谱法 以芥子酸为介质，通过飞行质谱测量供试品分子量，由于偶联物的分子量与载体的分子量不同，在飞行质谱中的飞行速度有所不同，根据完全抗原的质荷比(m/z)与载体的质荷比(m/z)，可以计算得出完全抗原中半抗原与载体的结合摩尔比［32］，该方法最大优点为供试品用量少，灵敏度高，结果直观，但对仪器要求较高。

4.4 其他方法 上述几种方法已可满足绝大多数半抗原的完全抗原鉴别，近年来也有人使用凝胶-高效液相色谱法［21］、核磁共振法［33］、圆二色光谱法［34］、原子力显微观察法［35］、荧光光谱法［36］等新方法对完全抗原进行鉴别。

5 中药有效成分半抗原抗体在中药领域的应用

目前国内外研究者大多利用中药有效成分半抗原偶联制备完全抗原，然后用其对小鼠进行免疫，再使免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，用培养基筛选出融合成功的杂交瘤细胞，再将该细胞进行体外扩大培养，接种于小鼠腹腔，再从其腹水中分离出高效价的单克隆抗体(Mab)。MAb可用于建立新的免疫分析方法对中药原药材进行检测分析［37］、制备免疫亲和柱获取高纯度的中药有效成分［38］、制备单链抗体基因提高中药有效成分的产量［39］、研发单克隆抗体药物［40］等。

多克隆抗体(PAb)的制备则相对于单克隆抗体简单，只需利用中药有效成分半抗原偶联制备完全抗原后，然后用其对动物进行免疫，当抗体效价符合要求后，即可直接取血分离血清，再行硫酸铵法-葡聚糖凝胶-阴离子交换柱技术即可获得纯化后PAb。PAb可用于制备免疫亲和柱剔除中药或方剂中特定成分［21］、确定中药有效成分作用靶点［23］等。

6 展望

目前国内外对中药有效成分半抗原研究仅仅停留在单味中药材的药物分析层面上，日本九州大学正山和田中实验室获得了近40种针对中药有效成分的单克隆抗体，但并未到达中成药、复方制剂、中药有效成分制剂的高度;复方中药的有效成分的药理分析，尤其是有关方中的配伍规律及作用机制方面的报道则相对较少，这一方面固然是复方中药组成的多样性和活性成分的作用多靶标有关，导致对每种活性成分的筛选和纯化、药理分析的困难;另一方面也说明目前的有效成分的筛选和评价模型尚待改进。中药有效成分是使中药具有治疗作用的物质基础，对于复方中药而言，其总的疗效并非是多个活性成分生物效应的简单叠加，其间存在着可能的协同或拮抗等相互作用不可忽视，而应是其主要有效成分以及次要成分相互作用的综合效应。因此，目前普遍采用的分离单一活性成分进行药理分析的方法不能反映复方中有效成分之间以及与次要成分之间相互作用的实际情况。而利用中药有效成分半抗原抗体建立的免疫分析法则具有前处理简便、特异性高、分析成本低等特点，特别适用于样品数目大而活性成分含量低时的分析测定，是中药生产过程中的质控的可选手段之一，为复方中药的药物化学分析和药理学研究提供了新的技术选择和可能。本课题组拟将中药有效成分半抗原免疫分析技术应用于中药注射剂重症过敏反应致敏原成分筛查。还有不可忽视的是中药半抗原抗体还有望被开发成治疗药物:一些中草药中含有毒性成分，盲目服用或服用过量会对人体造成危害，如果有针对该成分的单克隆抗体，利用抗原抗体的特异性反应，可在病人体内将该毒性成分中和，使其不能发挥生物活性，从而保证病人不受损害。由此可以预见，中药有效成分半抗原抗体将在中药现代化领域有着不可替代的优势与广阔的应用前景。

［1］徐国良，张增珠，张卓辉，等.绿原酸完全抗原的制备及鉴定［J］.卫生研究，2008，37(6):690-692.

［2］王婷婷，严睿文，陈 勤，等.阿魏酸人工抗原合成与光谱鉴别的研究［J］.中国药学杂志，2008，43(8):629-631.

［3］Shinkaruk S，Lamothe V，Bennetau B，et al.Development and validation of two new sensitive ELISAs for Hesperetin and Naringenin in biological fluids［J］.Food Chem，2010，118(2):472-481.

［4］Houerou C L，Lamothe V，Bennetau B，et al.Syntheses of Novel Hapten-Protein Conjugates for Production of Highly specific Antibodies to Formononetin，Daidzein and Genistein［J］.Tetrahedron，2000，56:295-301.

［5］Nagasaki T，Yasuda S，Imai T，et al.Preparation of antibody against agatharesinol，a norlignan，using a hapten-carrier conjugate［J］.Phytochemistry，2001，58:833-840.

［6］Zhu S，Shimokawa S，Shoyama Y ，et al.A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins［J］.Fitoterapia，2006 ，77(2):100-108.

［7］Xu Jinsen，Tanaka H ，Shoyama Y ，et al.One-step immunochromatographic separation and ELISA quantification of glycyrrhizin from Traditional Chinese medicines［J］.J Chromatogr B，2007，850:53-58.

［8］Morinaga O M ，Tanaka H ，Shoyama Y ，et al.Detection and quantication of ginsenoside Re in ginseng samples by a chromatographic immunostaining method using monoclonal antibody against ginsenoside Re［J］.J Chromatogr B，2006，830:100-104.

［9］Paul G，Raybould T J G，Gary S B，et al.An enzyme immunoassay for the determination of taxol and taxanes in Taxus sp.tissues and human plasma［J］.J Immunol Methods，1993 ，158(1):5-15.

［10］Tourdan P S，Mansell R L，Oliver D G ，et al.Competitive solidphase enzyme-linked immunoassay for the quantification of limonin in citrus［J］.Ana Bionchem，984 ，138(1):17-21.［11］Tam J P.Recent advances in multipe antigen peptides［J］.J Immunol Methods，1996，196(1):17-32.

［12］Maiken K，Pedersen A ，Nanna S.Effect of different haptencarrier conjugation ratios and molecular orientations on antibody affinity against a peptide antigen［J］.J Immunol Methods，2006，311(1-2):198-206.

［13］Greg T H.Preparation of Hapten-Carrier Immunogen Conjugates［M］.Bioconjug Tech，1996，419-455.

［14］Yi Feng，Zhou You Xiang，Zou Qiang，et al.Preparation and characterization of bisphenol A-cationized bovine serum albumin based on Mannich-type reaction［J］.J Immuno Methods，2009，340(2):138-143.

［15］王传武，赵德明.用实验动物制备多克隆抗体II.关于佐剂的评价［J］.实验动物科学与管理，2003，20(1):43-45.

［16］Leenaars P P A M ，Koedam M A ，Werter P W ，et al.Assessment of side-effect induced by injection of different adjuvant/antigen combinations in rabbits and mice［J］.Laboratory Animals，1998，32:387-406.

［17］Collier L H ，Polakoff S，Mortimer J.Reactions and antibody reponses to reinforcing doses of absorbed and plain tetanus vaccines［J］.Lancet，1979，8131:1364-1367.

［18］吕风林，何风慈.利用纳米材料制作多肽疫苗佐剂的思考［J］.生物化学与生物物理进展，2001，28(6):832-835.

［19］Brian Law.Immunoassay:A Practical Guide［M］.London/New York:Taylor＆ Francis Ltd，1996，16.

［20］Seiichi S，Waraporn P，Hiroyuki T，et al.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)using highly-specific monoclonal antibodies against plumbagin［J］.Analytica Chimica Acta，2008，607:100-105.

［21］陈 亮，陈 婷，徐 强，等.免疫亲和色谱特异性剔除中药方剂四逆散中的柚皮苷［J］.色谱，2006，24(3):243-246.

［22］杨新平，陈 旭，李芳耀，等.中药莪术中抗肿瘤成分莪术醇人工抗原的合成与鉴定［J］.时珍国医国药，2010，21(5):1054-1056.

［23］唐 波，刘 晓，徐晓昱，等.雷公藤内酯醇人工抗原的合成及多克隆抗体的制备［J］.东南大学学报:医学版，2008，27(6):409-414.

［24］Osamu M ，Tanaka H ，Shoyama Y.Production of monoclonal antibody against a major purgative component，Sennoside A，its characterization and ELISA［J］.Analyst，2000，125:1109-1113.

［25］Tian Min，Tanaka H ，Shang Mingying，et al.Production，characterization of monoclonal antibody against aristolochic acid II and development of its assay system［J］.Am J Chin Med，2008，36(2):425-436.

［26］马丽玲，晁 志，田中宏幸，等.紫杉醇完全抗原的合成鉴定及免疫原性分析［J］.中草药，2009，40(7):1045-1048.

［27］邵幼岩.芍药苷的单克隆抗体制备及其中药材的免疫法测定［D］.厦门:厦门大学.2008.

［28］侯世斌，李江伟，苏幼红，等.羟基红花黄色素A人工抗原的制备［J］.中草药，2008，39(10):1483-1486.

［29］Fodey T L.Use of antigen mimics to produce specific antibodies to anti-coccidial drugs［J］.J Immunol Methods，2007，323:31-38.

［30］田锋奇.黄芩苷的致过敏作用机制［D］.郑州:郑州大学，2007.

［31］侯世斌，吕 芳，苏幼红，等.抗羟基红花黄色素A抗血清的制备［J］.食品科学，2009，30(3):150-154.

［32］徐金森.MALDI-TOF-MS法测定芍药苷-人血清白蛋白复合物的半抗原数［J］.厦门大学学报:自然科学版，2006，45(z1):54-56.

［33］赵肃清，蔡燕飞，雷红涛，等.农药甲胺磷人工抗原的光谱鉴定研究［J］.光谱学与光谱分析，2004，24(2):207-209.

［34］吴锦绣，张 胤，李 梅，等.芦丁对血清白蛋白构象的影响［J］.光谱学与光谱分析，2008，28(11):2619-2622.

［35］何静仁.银杏酸的变应原性及致过敏作用机制研究［D］.武汉:华中农业大学，2003.

［36］刘雪锋，夏咏梅，方 云，等.中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用［J］.高等学校化学学报，2004，25(11):2099-2103.

［37］Fukuda N ，Tanaka H ，Shoyama Y.Applications of ELISA，Western blotting，and immunoaffinity concentration for survey of ginsenosides in crude drugs of Panax species and traditional Chinese herbal medicines［J］.Analyst，2000，125(8):1425-1429.

［38］Putalun W ，Fukuda N ，Tanaka H，et al.Immunoaffinity column for isolation of bioactive compounds using monoclonal antibodies［J］.J Liquid Chromatog Related Technol，2002，25(13-15):2387-2398.

［39］马丽玲，晁 志，田中宏幸，等.单链抗体技术及其在药用植物研究中的应用［J］.中草药，2006，37(7):附4-附6.

［40］朱宏斌，杨向民，陈志南.治疗性单抗的免疫原性研究进展［J］.中国免疫学杂志，2009，25(3):286-289.