壮阳健威丸质量标准研究

方翠芬， 陈 炜， 余潇苓， 祝 明

(1.浙江省食品药品检验所，浙江杭州310004;2.杭州胡庆余堂药业有限公司，浙江 杭州310016;3.浙江省中医院，浙江杭州310006)

壮阳健威丸是由人参、肉苁蓉、鹿茸等十六味药组成的复方制剂，具有补肾壮阳，生精益髓的作用，用于阳虚畏寒，腰膝酸痛，阳痿。该品种质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十册中(标准编号为:WS3-B-1923-95)［1］，原标准仅收载了人参和制何首乌的薄层色谱鉴别和常规检查项，经文献查阅，尚未见有壮阳健威丸中定量测定方法的报道。为控制药品质量，保证临床用药的安全性和有效性，按照国家标准提高计划的要求，我们参考文献，建立了枸杞子［2］和甘草［3］的薄层色谱鉴别，修改了人参［4］和制何首乌［5-6］的薄层色谱鉴别，制订了主要药味肉苁蓉中松果菊苷的HPLC测定方法［7-9］，建立的定性、定量方法均简便、准确、专属性强，可以有效地控制本品的质量。

1 仪器与试药

惠普1100高效液相色谱仪(惠普1100紫外检测器)，Waters2695高效液相色谱仪(Waters2487紫外检测器)，TU-1901紫外-可见分光光度计。

枸杞子对照药材，人参对照药材，甘草对照药材，2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Re对照品，松果菊苷对照品(111670-200502，供定量测定用)，均购自中国药品生物制品检定所。

壮阳健威丸样品由杭州胡庆余堂药业有限公司生产并提供，样品批号分别为080104、080105、080106。乙腈、甲醇为色谱纯(Merck)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 枸杞子的薄层色谱鉴别 取本品3 g，粉碎，加乙醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水5 mL，微热使溶解，离心，取上清液置于已处理好的聚酰胺柱(30～60目，内径1.5 cm，柱高10 cm，用水湿法装柱)上，用水50 mL洗脱，弃去水液，再用30%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，继用50%乙醇洗脱，收集洗脱液，备用。取30%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例及工艺制备的枸杞子阴性对照样品3 g，同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL、对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(5∶3∶2∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝色荧光斑点。见图1。

图1 枸杞子TLC图谱

2.2 制何首乌的薄层色谱鉴别 取枸杞子薄层色谱鉴别项下的50%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加无水乙醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取制何首乌对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加无水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。再取按处方比例及工艺制备的制何首乌阴性对照样品3 g，同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各5 μL、对照药材溶液和对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸(15∶0.7∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸硫酸溶液(取磷钼酸2 g，加水20 mL使溶解，再缓缓加入硫酸30 mL，摇匀)，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图2。

图2 制何首乌TLC图谱

2.3 人参的薄层色谱鉴别 取本品3 g，粉碎，加乙醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15 mL使溶解，用三氯甲烷15 mL振摇提取，弃去三氯甲烷液，水层用水饱15 mL ， ，0.6钠溶液15 mL振摇提取，碱水层备用，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取人参对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。再取按处方比例及工艺制备的人参阴性对照样品3 g，同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各2 μL、对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。见图3。

图3 人参TLC图谱

2.4 甘草的薄层色谱鉴别 取人参薄层色谱鉴别项下的备用碱水溶液，用盐酸调节pH值至2，加乙酸乙酯15 mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.2 g，加乙醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加0.6%氢氧化钠溶液15 mL使溶解，用水饱和正丁醇15 mL振摇提取，分取碱液，自“用盐酸调节pH值至2……”起，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例及工艺制备的甘草阴性对照样品3 g，同法制成阴性对照溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各5 μL、对照药材溶液2 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(UV365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。见图4。

图4 甘草TLC图谱

3 松果菊苷的测定

3.1 色谱条件 色谱柱:ZORBAX SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温30℃;流动相乙腈-甲醇-0.1%甲酸溶液(7∶16∶77);体积流量1.0 mL/min;检测波长330 nm。

3.2 对照品溶液的制备 取松果菊苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解，制成每1 mL含松果菊苷28.9 μg的溶液，即得对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备 取壮阳健威丸样品，粉碎成细粉，取约1 g，精密称定，精密加50%甲醇25 mL，称定质量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz)40 min，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备 取按处方比例及工艺制备的缺肉苁蓉样品，同供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。

在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪测定，色谱图见图5，松果菊苷的保留时间为23.6 min，与相邻组分达到基线分离，阴性对照无干扰。理论板数按松果菊苷峰计算应不低于3 000。

图5 HPLC色谱图

3.5 线性关系考察 精密吸取松果菊苷系列对照品溶液(质量浓度分别为 173.4、57.8、28.9、14.4、7.2、3.6、1.8 μg/mL)各20 μL，注入液相色谱仪，按上述条件测定峰面积，以峰面积为Y纵坐标，进样量为X横坐标进行线性回归，得回归方程:Y=1 314.4X-23.019;r=1.000 0，结果表明，松果菊苷在进样量0.036～3.468 μg范围内线性关系良好。

3.6 仪器精密度考察 精密吸取松果菊苷对照品溶液，按上述条件重复进样6次，测定峰面积，结果松果菊苷峰面积的RSD为1.0%(n=6)。表明仪器精密度良好。

3.7 重复性考察 取同一壮阳健威丸样品(批号:080104)6份，按3.3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，计算质量分数，结果平均质量分数为0.33 mg/g，RSD为0.7%(n=6)。

3.8 稳定性考察 取同一供试品溶液，室温下放置，按上述色谱条件，于 0、1、2、7、13、24、50 h 时测定，结果松果菊苷峰面积RSD为1.3%(n=7)，表明供试品溶液中松果菊苷在50 h内基本稳定。

3.9 加样回收率试验 取已测定的壮阳健威丸样品(批号:080104)9份，精密加入1、2、3 mL松果菊苷对照品溶液(87.75 μg/mL)，按3.3项下供试品溶液制备方法处理，测定，计算加样回收率，结果见表1。平均回收率为97.8%，RSD为1.2%。

表1 加样回收率实验结果

3.10 样品测定 按上述测定方法，对3批壮阳健威丸样品进行测定，结果见表2。

表2 样品测定结果

4 讨论

4.1 HPLC测定实验过程中，在200～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，发现松果菊苷的最大吸收波长为332 nm，参考《中国药典》［10］2005年版一部“肉苁蓉”含量测定项下的测定波长为330 nm，考虑到紫外吸收波长扫描有一定的偏差，最终参考药典，选择330 nm为测定波长。

4.2 定量测定耐用性考察［11］实验中考察了柱温(25℃、30℃、35℃)对色谱分离的影响，结果发现柱温的改变对供试品溶液的分离效果产生较大影响，而当柱温在30℃时，分离情况较好，故建议柱温控制在30℃。实验中比较了3种品牌的色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，依利特 Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，结果供试品在3种色谱柱上均能得到较好的分离。

［1］《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十册［S］.1995:53.

［2］苗明三，李振国.现代实用中药质量控制技术［M］.北京:人民卫生出版社，2000:715.

［3］孙国英，张春丽，黄 超，等.椰露止咳合剂中鱼腥草和甘草薄层鉴别方法的改进［J］.中药材，2009，32(7):1148-1150.

［4］莫结丽，隆 颖.救心丸中人参薄层色谱鉴别研究［J］.中国医药导报，2009，6(4):38-39.

［5］谢 岚.何首乌及二苯乙烯苷的研究进展［J］.天津药学，2010，22(3):70-73.

［6］高晓霞，严寒静，梁从庆.不同采集地制何首乌薄层色谱指纹图谱研究［J］.中国实验方剂学杂志，2007，13(5):4-6.

［7］李 媛，宋媛媛，张洪泉.肉苁蓉的化学成分及药理作用研究进展［J］.中国野生植物资源，2010，29(1):7-11.

［8］王哲民，王蔼英.HPLC测定苁蓉通便口服液中松果菊苷的含量［J］.中成药，2006，28(7):1072-1073.

［9］刘 雄，吴 蓉，余晓晖，等.HPLC法测定不同产地肉苁蓉中松果菊苷的含量［J］.甘肃中医学院学报，2009，26(5):42-44.

［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:126.

［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录130.