吉非替尼对脐带来源间充质干细胞表达MCP-1的抑制作用

王 林 陈 红 王 原 杜改萍 陈银苹 俞亮科 孙晓东

(河北联合大学附属医院药剂科，河北 唐山 063000)

间充质干细胞(MSCs)广泛应用于组织工程和细胞治疗〔1〕。MSCs还具有免疫调节作用，抑制树突细胞呈递抗原，改变单核巨噬细胞的活化状态，促进调节性T细胞的转化〔2〕。有研究报道，来源于脐带组织的MSCs(UC-MSCs)有类似来源于骨髓基质干细胞(BMSCs)的特性〔3〕。而且，脐带MSCs取材方便，对供者无损伤。表皮生长因子(EGF)是促进MSCs增殖的重要生长因子。有报道发现EGF可促进MSCs向脂肪和骨组织分化，并且可以产生破骨细胞形成促进因子(RANKL)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等单核巨噬细胞趋化因子，尤其是MCP-1对于单核巨噬细胞的生物学活性有重要的调节作用〔4〕。吉非替尼作为EGF受体的特异性抑制剂已经在临床中广为使用，多数癌症患者从中受益。然而，吉非替尼是否能够抑制EGF对MSCs的作用，尤其是调节MCP-1表达从而改变单核巨噬细胞的功能活性值得探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 UC-MSCs培养方法参照文献〔3〕。用磷酸盐缓冲液冲洗脐带组织样本，然后用0.075%Ⅰ型胶原酶37℃、30 min消化样本，然后用含10%胎牛血清的α-MEM培养基中和酶的活性，再将样本以1 200 r/min，10 min离心10 min，将沉淀物用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的α-MEM培养基培养于37℃、5%CO2孵箱。EGF购自R＆D公司。吉非替尼为临床应用药物，购自AstraZeneca。

1.2 方法

1.2.1 分组 分为空白对照组、EGF处理组、吉非替尼处理组、EGF联合吉非替尼处理组。EGF、吉非替尼作用浓度分别为10 ng/ml、4 μmol/L。联合组为EGF先作用24 h后再加吉非替尼作用4 h。

1.2.2 Real-Time PCR分析 根据产品说明书，采用TRIzol○RReagent(购自invitrogen公司)提取细胞总RNA并进行逆转录。以SYBR Green为高灵敏的DNA荧光染料(购自ABI公司)执行Real-Time PCR分析。分析所用的引物序列为:β-肌动蛋白(β-actin)(对照):5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3'，5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3';MCP-1:5'-GTCCTTCGGGCTCCTTGT-3'，5'-AACTTGCTTCCCGTTCTTCA-3'。

1.2.3 酶联免疫吸附实验(ELISA) 经台盼蓝实验鉴定用无血清培养基培养UC-MSCs 2 d不影响细胞活力，遂收集上清，并用ELISA试剂盒(R＆D公司)测定上清中MCP-1的浓度。按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 Transwell实验 分别收集各处理组的UC-MSCs培养上清，置于0.8 μm孔径的Transwell板(购自Nunc公司)中，于半透膜上层加入1×104单核细胞系RAW264.7(购自美国ATCC)。4 h后于显微镜以不同高倍视野(5个高倍视野)下计数细胞每个高倍视野平均细胞数。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，数据资料以±s表示，组间均数比较用两样本t检验。

2 结果

2.1 UC-MSCs中MCP-1表达 空白对照组、EGF组、吉非替尼组、EGF联合吉非替尼组MCP-1浓度分别为〔(7 632±532)、(1 654±627)、(496±421)、(1 081±723)ng/ml〕，对照组与其余3组比较差异显著(P＜0.05)，EGF组与EGF联合吉非替尼组比较差异显著(P＜0.05)，可见吉非替尼可有效抑制EGF对UC-MSCs表达和刺激MCP-1分泌的作用。

2.2 Transwell实验结果 空白对照组、EGF组、吉非替尼组、EGF联合吉非替尼组的单核巨噬细胞数分别为56.0±12.79、160.4±12.24、56.2±9.77、111.4±11.57，EGF组与 EGF联合吉非替尼组比较差异显著(P＜0.05)。

3 讨论

本研究证实，EGF可以显著刺激UC-MSCs分泌MCP-1，这种刺激体现在转录水平(实时定量PCR检测)和蛋白水平(ELISA检测)。同样MCP-1分泌变化对单核巨噬细胞的趋化功能有显著影响。作为EGF的抑制剂，吉非替尼在临床中广为应用〔4，5〕。目前主要是针对恶性肿瘤，尤其是特异性高表达生长因子受体的肿瘤，例如肺癌等。作为一种多效应靶点的生长因子，EGF除了能够刺激肿瘤细胞生长以外，对于机体各种其他成分的组成细胞也都有一定的促增殖作用。研究表明，EGF可以作为MSCs的有效扩增因子，对于干细胞的产业化和临床应用有重要的意义〔5，6〕。此外，EGF还可以促进 MSCs向骨组织、脂肪组织等分化。近年来注意到EGF可以促进成纤维细胞、间充质细胞和肿瘤细胞产生一些趋化因子，尤其是MCP-1蛋白。作为单核巨噬细胞特异性的趋化因子，MCP-1在诱导单核细胞成熟、趋化以及参与炎症和肿瘤组织浸润等生物学效应中发挥着重要的作用〔2，7〕。

前期研究观察到，EGF可以有效地促进MSCs分泌MCP-1，促进单核巨噬细胞的招募，在肿瘤发展过程中，MSCs可以促进肿瘤转移和炎症性单核巨噬细胞浸润。而本研究发现，给予吉非替尼处理后，EGF对MSCs分泌MCP-1具有抑制作用，这种抑制作用的效果在抑制MSCs招募单核巨噬细胞趋化过程中得以体现，从一个较新的角度提示吉非替尼对EGF受体相关肿瘤浸润和转移的抑制作用，为临床治疗肿瘤提供了一种新的思路和探索。

总之，吉非替尼可以有效抑制EGF对UC-MSCs作用，调节MCP-1分泌及其对单核巨噬细胞招募作用。结果不仅提示UC-MSCs与机体免疫细胞的相关性，也为吉非替尼抑制EGF相关肿瘤浸润移植治疗提供新的观点。

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