脓毒症中免疫负调控途径的研究进展*

栾樱译， 姚咏明

(1解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所，北京 100048；2南方医科大学基础医学院，广东 广州 510515)

脓毒症中免疫负调控途径的研究进展*

栾樱译1, 2， 姚咏明1△

(1解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所，北京 100048；2南方医科大学基础医学院，广东 广州 510515)

传统观念认为脓毒症(sepsis)是一种失控的、持久性全身炎症反应。目前，人们渐渐认识到，在脓毒症的发病过程中机体并非处于一成不变的免疫激活状态，负向调控机制在脓毒症的发生与发展中也发挥着重要作用。在脓毒症的初始阶段，以大量的促炎介质释放为主要特征，但随着病程的进展，机体可能经历了一个免疫负调控阶段，表现为淋巴细胞增殖能力下降，并呈现以辅助性T细胞(helper T-cell, Th)2为主的免疫反应和大量淋巴细胞凋亡等，从而使机体对病原体的易感性增加。本文拟就脓毒症中免疫负调控途径的研究新进展进行综述，进一步阐明引起脓毒症免疫功能障碍的发病机制，旨在为严重脓毒症的合理干预提供新思路。

1 不同细胞对脓毒症中机体免疫反应的负向调节作用

有资料显示，严重创伤后随着炎症反应的加重，机体自身存在着针对炎症刺激的有效负反馈调控机制，此时机体所表现出来的并非主要是炎症介质对机体的损害，宿主免疫功能低下，特别是机体抗感染免疫防御能力严重受抑，成为病情进一步恶化的主要原因[1]。在机体的负向调控机制中，不同免疫细胞亚群发挥着重要调节作用。

1.1调节性T细胞(regulatory T-cells, Treg) Treg作为一类具有免疫调节功能的成熟T细胞亚群，不仅在免疫自稳、移植耐受、肿瘤免疫、过敏反应等方面具有重要意义[2]，其在感染免疫方面可通过对细胞免疫抑制发挥核心调节作用。Treg的种类较多，一般依据其发育、特异性及作用机制多分为天然Treg和获得性Treg。天然Treg主要由胸腺发育成熟后进入外周淋巴组织，目前了解较多的是CD4+CD25+Treg；获得性Treg是成熟T细胞(CD4+CD25-T细胞)在外周淋巴组织中接触特异性抗原或免疫抑制因子如白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)的作用下活化而诱导产生，Th3、Treg1属于获得性 Treg[3]。Treg的免疫调节机制主要表现为免疫抑制性与免疫无能性。

① Treg介导的免疫功能抑制效应及T细胞分化失衡 在免疫应答正常或没有炎症损伤的情况下，Th亚群中Th1与Th2处于平衡状态。Treg介导的免疫抑制效应是经T细胞受体信号刺激活化后引起Th1/Th2的漂移。诸多资料显示，CD4+T细胞在不同细胞因子及共刺激分子的作用下分化为不同的效应性T细胞，一类是产生促炎细胞因子[TNF-α和干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)]的Th1，另一类是分泌抗炎介质(IL-4、IL-10)的Th2[4]。MacConmara等[5]观察到患者伤后7 d与正常健康组相比，Treg的抑制能力明显增强，这可能是由于Treg影响了Th1细胞因子的生成、抗炎介质IL-10产生增多促进CD4+T细胞向Th2分化所致。

现已明确，在脓毒症的发展过程中出现了倾向于Th2型的免疫反应，因此Th2分泌的IL-4、IL-10等增多而Th1型促炎因子产生减少，进一步导致机体的免疫功能紊乱[6]。机体通过Th1/Th2来实现免疫应答的平衡及转化，但对Treg介导Th1/Th2功能极化的决定因素目前仍不清楚，可能受病原体的种类、炎症发展的不同阶段及感染部位细胞因子微环境等多种因素影响[7]。

② Treg介导免疫无反应性及免疫细胞凋亡 在脓毒症病理过程中，Treg活性持续增高，加剧了免疫无反应状态，主要表现为对抗原刺激无反应性增殖也不分泌细胞因子IL-2，即使在高浓度外源性IL-2存在的条件下，CD4+CD25+Treg可以活化和增殖，但增殖程度较CD4+CD25-T细胞减弱很多。除了表现为免疫耐受，Treg还能通过FasL/Fas途径诱导细胞凋亡，其具体过程大致为FasL与Fas结合后使胞浆中Fas相关的死亡结构域蛋白与Fas受体的死亡结构域作用，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease, caspase)-8引起凋亡。此外，Fas与其受体结合后引起线粒体细胞色素C释放，激活caspase-8途径促进凋亡，Fas介导的凋亡在清除外周激活CD4+T细胞中发挥关键作用，并介导细胞毒性T细胞及NK细胞杀伤病毒感染细胞和癌细胞[2]。

1.2调节性树突状细胞 树突状细胞(dendritic cells, DCs)被认为是免疫系统的启动者，在外周组织中捕获并处理抗原，通过血液分布于全身。当病原微生物及组织损害等激活机体非特异性免疫系统时，DCs在呈递异体抗原及自体抗原活化效应性T细胞的同时，也诱导了Treg的增殖，未成熟DCs刺激初始T细胞活化增殖的能力较差，诱导生成更多的Treg。有实验观察到患者DCs表面主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅱ及共刺激分子(CD80、CD86)的表达水平显著降低，随时间推移DCs趋向于不成熟且比例增高[8]，提示DCs诱导产生效应性T细胞还是Treg取决于其成熟状态，即成熟与未成熟DCs的比例。未成熟的DCs与成熟DCs的区别是低表达CD11c而高表达CD45RB，作为DCs的一个亚群，低表达共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子，表现为类浆细胞样形态和不成熟样表型，被激活后分泌高水平的IL-10[9]。IL-10可进一步影响下游细胞的分化与功能实现，诱导Treg的生成，Treg分泌的IL-10则反过来促进DCs的分化，同时抑制Th1型细胞因子的生成[10]。可见，在此过程中调节性DCs释放的细胞因子影响着Treg的免疫活性，进而调节机体的免疫功能。

1.3γδT细胞和NK-T细胞 γδT细胞和NK-T细胞主要分布于黏膜淋巴样组织，它们在血液、脾、外周淋巴结中也有少量分布。这两种细胞的功能较为复杂，可能同时产生Th1和Th2型细胞因子，烧伤及脓毒症小鼠研究发现，γδT细胞可能对维持天然及细胞免疫反应有重要意义。有资料显示，严重烧伤后CD8+CD11b+γδT细胞在脾组织中明显增加，并抑制淋巴细胞增殖，CD8+CD11b+γδT细胞与大多数γδT细胞截然不同，主要分泌Th2型细胞因子，回输该细胞至正常小鼠体内可明显增加小鼠对脓毒症的易感性；NK-T细胞对于眼等局部炎症反应具有维护功能，但可在一定条件下诱发免疫抑制[1]。这些结果显示，严重烧伤、创伤后脓毒症γδT细胞和NK-T细胞对机体的免疫功能可能起到负向调控作用。

2 脓毒症时参与免疫负向调节的重要分子

2.1肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2(tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2, TIPE2)在免疫负调控中的作用

① TIPE2的结构特征 TIPE2系一种肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8家族成员之一，主要选择性表达于淋巴源性和髓源性细胞[11]。在结构上，TIPE2包含6个逆向平行的α单环，其中螺旋α5包含一个由脯氨酸153形成的扭结，可分为α5a和α5b两个较短的单环，并作为螺旋状束支的基础。此外，TIPE2结构有一个典型的特征，即位于中心的大疏水腔，可与辅助因子结合，在维持免疫自稳方面可能发挥重要作用；当接受免疫刺激时，其它辅助因子可以竞争性占据空腔，引起免疫活化因子的释放并伴随免疫反应的激活[12]。

② TIPE2的免疫调节效应 在急性损伤或脓毒症过程中，一些免疫负调控分子发挥着重要作用。TIPE2被认为是维持免疫稳态所必需的，并在炎症组织中呈现高表达状态。有研究发现，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激巨噬细胞TIPE2可下调多条信号转导通路，尽管TIPE2不能直接作用于细胞外信号调节激酶通路，但其能抑制c-jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的活化，从而减弱转录因子激活蛋白(activator protein, AP)-1的活性；TIPE2耗竭则可增强核因子(nuclear factor, NF)-κB序列的核转录和IκB的磷酸化。Sun等[13]发现TIPE2与前凋亡caspase-8存在联系，且可能通过前凋亡酶调节NF-κB通路。有证据表明，TIPE2能抑制AP-1和NF-κB的活化，且TIPE2基因缺陷细胞呈现出对Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)和T细胞受体信号活化的高反应性[11-13]。此外，小剂量LPS诱导脓毒症小鼠模型，与正常野生型组相比，TIPE2基因敲除组出现明显脓毒性休克反应，血清检测发现，TIPE2基因表达下调引起持续性淋巴细胞活化，可能导致Fas表达增强并促进淋巴细胞凋亡，TIPE2基因缺陷则引起细胞因子IL-4、IL-6、IL-12和IFN-γ的生成增多[13]。另据报道，TIPE2还具有调节细胞死亡的功能，沉默TIPE2基因表达可抑制Fas介导的凋亡及抗原受体诱导细胞死亡，尽管TIPE2结合caspase-8，但在死亡诱导信号复合物的Fas连接上未发现TIPE2、且未阻滞Fas相关的死亡结构域蛋白与caspase-8的募集[14]。因此，TIPE2作为一种新发现的蛋白，在免疫稳态中发挥了重要作用，主要表现为对天然免疫反应的负向调节效应。

2.2热休克蛋白的生物学功能及其免疫负调控作用

热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是一组普遍存在于真核细胞中的蛋白质，根据其作用及调控方式，可以分为诱导型HSP和构成型HSP[15]。在正常生理及代谢条件下主要表现为构成型HSP表达增多，当多种应激因素如高热、营养不良、缺氧及大量炎症介质存在时，则引起细胞内代谢异常等一系列改变，此时细胞合成诱导型HSP[16]。研究表明，HSP受体识别范围广，能与多种配体结合，在脓毒症免疫负调控中发挥重要作用。一方面，协同诱导HSP的复合物也是一种NF-κB的抑制物，蛋白酶体抑制因子阻滞了IκBα的降解进而抑制NF-κB活化及核转录。此时，蛋白酶体抑制因子促使非正确折叠蛋白胞质内容物生成增多，因而诱导热休克反应；另一方面，热休克反应中NF-κB通路的阻滞不仅需要稳定IκBα活性还增加其表达[17]。在炎症存在的情况下，HSP特异性Treg通过抑制性细胞因子识别应激细胞内诱导型HSP的表达。因此，HSP参与了免疫反应的负向调控过程，并在应激状态下对机体发挥保护作用。

2.3锌指蛋白A20与免疫负反馈调节 锌指蛋白A20，亦称为TNF-α诱导蛋白3(tumor necrosis factor-α induced protein-3, TNFAIP3)。锌指蛋白A20对核因子NF-κB及其基因表达起负向调节作用，参与了NF-κB激活的负反馈调节[15]。锌指蛋白A20过表达能阻断由TNF-α、IL-1、LPS、佛波醇酯和过氧化氢所致NF-κB激活，还能抑制TNF-α介导的NF-κB依赖性蛋白如E选择素、血管细胞黏附分子-1等的产生[16]。在TNF-α作用或TNF受体-1过度应答时，锌指蛋白A20通过阻断κB抑制蛋白激酶(inhibitor κB kinase, IKK)-γ 将上游信号转导给IKK-α和IKK-β亚基，进而抑制NF-κB的活化[17]。在LPS刺激下，与正常野生型小鼠相比，锌指蛋白A20缺陷小鼠产生大量TNF-α、IL-6和一氧化氮，且体内实验显示锌指蛋白A20通过下调LPS诱发的天然免疫反应，可以防止小鼠内毒素性休克的发生[18]。

3 细胞信号通路分子在脓毒症免疫负调控中的意义

3.1细胞因子信号转导抑制因子 创伤、休克及脓毒症时机体存在着免疫功能的负向调控途径，其效应与信号转导通路的调控密不可分，包括信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)、细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)活性变化，最终导致某些基因表达的下调。Janus激酶(Janus kinase, JAK)/STAT途径受多种机制的调节，但在这些机制中SOCS被认为是JAK/STAT的特异性内源性抑制物并参与了其信号转导的负反馈调节过程，从而有效地维持机体的免疫自稳状态。

业已明确，SOCSs家族至少存在8个成员，即SOCS1-7和细胞因子诱导的Src-同源结构2(SH2)包含蛋白(CIS)，其中SOCS1、SOCS2、SOCS3和CIS在机体免疫调控中的作用尤为突出，它们可分别通过与磷酸化JAK或受体的胞浆区直接结合抑制STAT的酪氨酸磷酸化，从而中断细胞因子的信号转导过程。据报道，SOCS1和SOCS3-SH2可与JAK中Y1007活化部位结合，从而抑制其活性[19]；而SOCS2和CIS与受体结合磷酸化进一步抑制细胞因子受体的信号转导[20]。SOCSs基因启动子上通常有1个甚至数个STAT结合位点，因此SOCS参与了调节JAK/STAT通路的病理生理过程。

3.2TLRs介导的细胞内信号通路在脓毒症免疫负调节中的作用 在感染过程中， TLRs作为识别病原体共有成分的模式识别受体在脓毒症的发生与发展中可能居于核心地位[21]。近年来研究提示，TLR介导的信号转导通路亦参与了免疫负调节过程，并可通过多水平调节介导其免疫负调控功能。

一般情况下，信号转录因子降解或失去稳定性时，将减少或终止信号通路的活化。泛素分子通过部分负调控子调节TLR介导的信号通路，例如Triad3(Triad domain-containing protein 3)过表达可明显促进TLR4及TLR9的降解但并不影响TLR2的表达，同样TLR4与TLR9的诱导信号减弱而TLR2信号正常[22]。新近研究发现，TLRs在不同的病原结合分子间分化，进而激活信号级联导致免疫反应，RP105(radioprotective 105)是TLR4的特异性同系物，其与辅助分子髓样分化蛋白(myeloid differential protein, MD)1和TLR4/MD2存在关联性，这种关联性可以抑制LPS-TLR4/MD2复合物的形成，从而阻滞TLR信号通路[23]。TLR介导的负向调节通路，是通过竞争与各种接头蛋白、转录因子的结合实现的，髓样分化因子(myeloid differential factor, MyD)88存在于除TLR3外的所有TLRs中，主要包括氨基末端结构域、中间结构域和TIR结构域，低表达中间结构域的MyD88被视为TLR信号通路抑制子的负调节结构域，MyD88过表达明显抑制LPS所致NF-κB活化[24]。因此，免疫细胞功能失调与TLRs介导的信号转导通路的调控密不可分，TLRs的表达和功能在机体免疫负调控中作用显著，其功能调节可能是把“双刃剑”，在天然免疫系统对感染的控制上具有重要意义。

4结语

机体在免疫应答正常或没有外界急性损害的情况下，正向与负向调控处于平衡状态并维持各项生命活动的正常运行。但创伤、休克及脓毒症时机体不仅出现过度的炎症反应，而且存在着严重细胞免疫紊乱，此时与免疫负调控效应密切相关。机体免疫功能障碍的原因是多方面的，不论是抑制性免疫细胞、细胞因子或是信号转导通路的变化均为负调控发挥作用的重要途径，因此深入了解负向调控在脓毒症中的确切作用及其机制，在不同的环节采取针对性方法进行精确干预将有助于恢复机体正常的免疫应答反应、进一步防止严重感染并发症的发生与发展，最终为脓毒症的预防与治疗提供新的线索和途径。

[1] 姚咏明, 柴家科, 林洪远. 现代脓毒症论与实践[M]. 第1版. 北京：科学出版社, 2005.402-420.

[2] Mellor AL, Baban B, Chandler PR, et al. Cutting edge: CpG oligonucleotides induce splenic CD19+dendritic cells to acquire poment indoleamine 2,3-dioxygenase-dependent T cell regulatory functions via IFN Type 1 signaling[J]. J Immunol, 2005, 175(9): 5601-5605.

[3] Ochs HD, Oukka M, Torgerson TR. Th17 cells and regulatory T cells in primary immunodeficiency diseases[J]. J Allergy Clin Immunol, 2009, 123(5): 977-983.

[4] Mosmann TR, Coffman RL. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties[J]. Annu Rev Immunol, 1989, 7: 145-173.

[5] MacConmara MP, Maung AA, Fujimi S, et al. Increased CD4+CD25+T regulatory cell activity in trauma patients depresses protective Th1 immunity[J]. Ann Surg, 2006, 244(4): 514-523.

[6] Huang LF, Yao YM, Dong N, et al. Association between regulatory T cell activity and sepsis and outcome of severely burned patients: a prospective, observational study[J]. Crit Care, 2010, 14(1): R3-R13.

[7] 姚咏明. 关注调节性T细胞在脓毒症中的免疫学意义[J]. 中华急诊医学杂志, 2009, 18(2): 117-119.

[8] 白祥军, 唐朝晖, 邹声泉, 等. 创伤早期患者外周血树突状细胞的变化及临床意义[J]. 中华实验外科杂志, 2003, 20(11): 978-980.

[9] Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, et a1. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor[J]. Annu Rev Immnol, 2001, 19: 683-765.

[10]Wakkach A, Fournier N, Brun V, et al. Regulatory dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cells differentiationinvivo[J]. Immunity, 2003, 18(5): 605-617.

[11]Li D, Song L, Fan Y, et al. Down-regulation of TIPE2 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus[J]. Clin Immunol, 2009, 133(3): 422-427.

[12]Zhang X, Wang J, Fan C, et al. Crystal structure of TIPE2 provides insights into immune homeostasis[J]. Nat Struct Mol Biol, 2009, 16(1): 89-90.

[13]Sun HH, Gong SY, Carmody RJ, et al. TIPE2, a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintain immune homeostasis[J]. Cell, 2008, 133(3): 415-426.

[14]Freundt EC, Bidere N, Lenardo MJ, et al. A different TIPE of immune homeostasis[J]. Cell, 2008, 133(3): 401-402.

[15]Sun SC. Deubiquitylation and regulation of the immune response[J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8(7): 501-511.

[16]解 婧, 王杰军. 锌指蛋白A20与恶性肿瘤相关性研究的进展[J]. 临床肿瘤学杂志, 2010, 15(1): 86-89.

[17]Rothwarf DM, Zandi E, Natoli G, et al. IKK-γ is an essential regulatory subunit of the IκB kinase complex[J]. Nature, 1998, 395(6699): 297-300.

[18]Boone DL, Turer EE, Lee EG, et al. The ubiquitin-modifying enzyme A20 is required for termination of Toll-like receptor responses[J]. Nat Immunol, 2004, 5 (10): 1052-1060.

[19]Yasukawa H, Misawa H, Sakamoto H, et al. The JAK-binding protein JAB inhibits Janus tyrosine kinase activity through binding in the activation loop[J]. EMBO J, 1999, 18(5): 1309-1320.

[20]Croker BA, Kiu H, Nicholson SE. SOCS regulation of the JAK/STAT signalling pathway[J]. Semin Cell Dev Biol, 2008, 19(4): 414-422.

[21]卢中秋,李萌芳,梁 欢,等,乙醇性肝病大鼠孤菌脓毒症肝组织Toll样受体及髓样分化蛋白-2的表达变化[J].中国病理生理杂志,2009,25(1):133-136.

[22]Chuang TH, Ulevitch, RJ. Triad3A, an E3 ubiquitin-protein ligase regulating Toll-like receptors[J]. Nat Immunol, 2004, 5(5): 495-502.

[23]Divanovic S, Trompette A, Atabani SF, et al. Negative regulation of Toll-like receptor 4 signaling by the Toll-like receptor homolog RP105[J]. Nat Immunol, 2005, 6(6): 571-578.

[24]Wang J, Hu Y, Deng WW, et al. Negative regulation of Toll-like receptor signaling pathway[J]. Microbes Infect, 2009, 11(3): 321-327.

Updateonimmunologicalpathwayofnegativeregulationindevelopmentofsepsis

LUAN Ying-yi1, 2, YAO Yong-ming1

(1BurnsInstitute,FirstHospitalAffiliatedtoChinesePLAGeneralHospital,Beijing100048,China;2SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:c_ff@sina.com)

Sepsis is not only a primitively systemic inflammatory response to presumed or known infection, but also closely related to the immune status. In the initial stage of sepsis, a phase of immune activation could be evident, but a marked apoptosis-induced depletion of lymphocytes and a series of impairments in nonspecific immunological functions following severe trauma and burns appear to be responsible to the susceptibility of subsequent septic complications. Presently, negative regulation has been shown to play a pivotal role in the maintenance of peripheral homeostasis and regulation of immune responses. Understanding the basic immunological pathway of negative regulation should provide novel insights into the mechanisms of sepsis and immune homeostasis. This review provides a summary of the negative-regulatory pathways that are involved in the pathogenesis of sepsis.

免疫； 炎症； 负调控； 脓毒症

Immunity; Inflammation; Negative regulation; Sepsis

R363

A

1000-4718(2011)03-0616-05

2010-06-28

2010-10-19

国家自然科学基金资助项目(No.30901561);国家重点基础研究发展计划资助项目(No.2005CB522602)

△通讯作者 Tel:010-66867394；E-mail: c_ff@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.040