融合蛋白AML1-ETO的生物学功能及致癌机制探讨*

刘晓晓， 张 波， 赵 倩△

(1上海交通大学医学院病理生理教研室； 2中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学医学院 健康科学研究所，上海 200025)

·综述·

融合蛋白AML1-ETO的生物学功能及致癌机制探讨*

刘晓晓1,2， 张 波1， 赵 倩1△

(1上海交通大学医学院病理生理教研室；2中国科学院上海生命科学研究院/上海交通大学医学院 健康科学研究所，上海 200025)

AML1-ETO融合蛋白是染色体易位t(8;21)(q22;q22)的产物，见于15%的急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia, AML)，在FAB (French-American-British, FAB) 分型M2型白血病中的阳性率为40%-50%，其中M2b亚型中的阳性率为90%，少见于M0、M1和M4型白血病，极少见于骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome, MDS)。AML1-ETO融合蛋白全长含有752个氨基酸，其N端为RUNX1(runt-related transcription factor 1), 也称为AML1、CBFα2或者PEBP2αB区，含有结合DNA的结构域；C端为8号染色体编码的RUNX1T1 [runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclin D-related)]，也称为ETO(eight-twenty-one)。

AML1蛋白与ETO蛋白融合后使AML1蛋白从转录活化因子转变为转录阻遏物，抑制AML1靶基因转录表达。研究还发现表达AML1-ETO的 U937细胞的确出现了分化阻滞，同时又出现了细胞凋亡敏感性增强的现象[1]。利用表达AML1-ETO转基因小鼠的研究也发现，转基因小鼠出现了造血系统的异常，但并未发生白血病[2]。因此基因的二次打击事件引起了研究者的注意，研究者认为融合基因AML1-ETO的产生增加了基因组的不稳定性，基因组发生了其它的基因改变事件，促发了白血病的发生。文献报道在许多t(8;21)阳性的病人基因中发现了有kit基因(也称为c-kit基因)的突变以及异常的AML1-ETO截短体的存在。

1 融合蛋白AML1-ETO的生物学功能

融合蛋白AML1-ETO是染色体t(8;21)(q22;q22)的产物。AML1由染色体21q22编码，是造血分化过程中的一个重要的转录因子。AML1是一种具有DNA结合序列特异性的DNA结合蛋白，属于核心结合因子家族(core-binding factors，CBFs)，AML1即CBFα2，需要与CBFβ亚基形成异二聚体来活化靶基因的转录。在异二聚体中AML1亚基具有结合DNA的能力，CBFβ亚基不直接与DNA结合而是与AML1亚基结合并增强AML1与DNA结合的能力。ETO基因位于染色体8q22，ETO也称为MTG8。融合蛋白AML1-ETO几乎包含了ETO蛋白的全长，ETO蛋白含有4个与Nervy蛋白同源的功能域(NHR1-4)。NHR2功能域含有疏水性氨基酸7 肽重复序列，能介导ETO家族成员间的二聚化，二聚化的NHR2能与mSin3A/HDAC共抑制复合物发生作用。NHR4功能域含有2个锌指结构，能够募集N-CoR/SMRT/HDAC共抑制复合物[3]。

1.1融合蛋白AML1-ETO的转录抑制作用 融合蛋白AML1-ETO可作用于AML1的靶基因，与DNA启动子或增强子区域的序列结合，而且保留了与CBFβ形成二聚体的能力。在正常情况下，AML1作为大部分靶基因的转录活化因子，作用于靶基因的启动子区域促进基因的转录活化。但在发生t(8;21)染色体易位后，融合蛋白AML1-ETO丢失了AML1 C末端的活化功能域，AML1-ETO通过RUNX1的RHD结构域作用于AML1的靶基因，ETO通过它的NHR功能域招募转录共阻遏物，如mSin3A、SMRT以及组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)。因此AML1-ETO对于AML1的靶基因来说是一个转录阻遏物，抑制靶基因的转录活化[4]。在对AML1-ETO融合基因Knock-in 小鼠的研究中发现，AML1-ETO 是通过一种显性负作用的方式抑制AML1-依赖 的转录活化。Knock-in 1个AML1-ETO等位基因的杂合子小鼠出现的表型与敲除AML1或CBFβ的小鼠出现的表形类似，它们均在胚胎期(胚胎期的13.5 d)死亡，伴随有颅内出血和造血细胞分化的阻滞[5]。利用线虫作为模式动物也发现，在它的胚胎造血细胞中过表达AML1-ETO，可以抑制RUNX1+血细胞系的分化，并导致了在蛹期的100%致死率[6]。

AML1基因是在发育早期表达的基因，在卵黄囊造血的后期以及胚肝造血期对造血干细胞的出现起着重要的作用，但当胚胎的后期造血完全以骨髓为主时，AML1的功能则主要侧重于参与干细胞的定向分化[7]。在髓系前祖细胞中表达融合蛋白AML1-ETO 则会阻滞粒系的分化。对粒系分化的阻滞作用主要是由于AML1与ETO的融合使得AML1从转录活化因子转变为转录阻遏物，导致与粒系分化相关的靶基因如两个重要的转录因子C/EBPα、PU.1 表达下调[8，9]。最新研究发现Pirin(PIR) 在表达融合蛋白AML1-ETO的白血病细胞中表达明显下调，而PIR是一种新发现的转录调节因子，它对髓系细胞的分化成熟起着重要的作用，所以PIR的表达下调可能是导致白血病细胞分化阻滞的原因之一[10]。

1.2融合蛋白AML1-ETO在造血干细胞增殖中发挥作用 在纯化的造血干细胞中表达AML1-ETO 后移植到小鼠体内10个月后发现骨髓内原始粒细胞增加了约10%，与此相符合的是表达AML1-ETO的造血干细胞髓系集落形成细胞增加了50倍，同时在骨髓内可发现晚幼粒细胞的累积还伴有数目增多的不成熟的嗜酸性粒细胞，这些嗜酸性粒细胞内有不正常的嗜碱性颗粒。还发现与对照小鼠比较，移植10个月后，造血干细胞的数目增加了29倍，这暗示AML1-ETO的表达破坏了正常的基因对“造血干细胞池”大小的控制和调节[11]，在随后的基因微阵列分析中发现，AML1-ETO可以活化许多基因的表达，许多被AML1-ETO活化的基因在干细胞的自我更新中起作用[4]。Alcalay等[12]发现AML1-ETO可诱导Jagged1的表达，Jagged1是一种Notch配体，具有促进干细胞增殖的能力，Jagged上调引发了Notch通路的活化而且在t(8;21)阳性的AML细胞表达Notch靶基因HES1。此外，AML1-ETO可以促进微小RNAmiR-24的转录表达，而miR-24具有促进髓系细胞增殖，抑制髓系细胞分化的作用[13]。在人类CD34+造血干祖细胞中高表达AML1-ETO 可以增强外源性的神经生长因子以及IL-3 对细胞的生长促进作用。以上发现可得出这样的结论：在造血干祖细胞中AML1-ETO通过反常上调Jagged1以及miR-24等靶基因来促进早期多潜能造血祖细胞的增殖。

1.3融合蛋白AML1-ETO对靶位点的表观遗传学修饰作用 在对AML1-ETO下调的靶基因研究中发现，靶基因的AML1结合位点以及转录起始位点存在着异常的组蛋白去乙酰化改变，并且发现其中一个基因Mgmt的启动子区域有CpG 岛，这个CpG岛存在着超甲基化现象。这些表观遗传学修饰导致染色体发生抑制性的改变，如结构变得更加紧密等，从而抑制相应靶基因的转录。这个研究表明与白血病相关的融合蛋白可以在基因组的特定位点产生独特的表观遗传学的抑制作用，并且这些表观遗传学的改变并非是随机的[14]。最近有研究发现微小RNAmiR-223是融合蛋白AML1-ETO作用的靶基因[15]，而miR-223对髓系分化发挥着重要的调节作用[16]。在许多t(8;21)阳性病人的白血病细胞中都发现有明显的miR-223表达下调，这主要是由于AML1-ETO 招募去乙酰化酶和甲基化酶使得pre-microRNA基因组上游序列发生去乙酰化和超甲基化，使得染色体构型改变，导致了miR-223的表观遗传学沉默。RNAi干扰AML1-ETO或使用去甲基化治疗都可以提高miR-223的表达水平，并恢复了细胞分化能力。因此AML1-ETO 可以通过对不同靶基因进行表观遗传学的修饰，改变染色体构型从而影响相关靶基因转录和阻滞细胞的分化。

2 融合蛋白AML1-ETO在人类急性白血病发生及发展中的作用

AML1-ETO一方面具有转录抑制作用，可以抑制一些与造血分化相关的重要转录因子、集落刺激因子受体以及其它重要蛋白如细胞周期蛋白的表达，导致了造血细胞分化的阻滞。同时AML1-ETO 在造血干细胞阶段具有转录激活作用，可以转录活化部分与造血干细胞自我更新功能相关的基因，促进造血干细胞增殖，扩大造血干细胞池。有学者提出这样的观点：融合蛋白AML1-ETO一方面使一些原始的造血干细胞或前祖细胞增殖，即扩池作用；另一方面它阻滞这些原始细胞的分化，即关闭闸门作用；这样使得原始的幼稚造血细胞越来越多，从而导致白血病的发生[4]。

但是，AML1-ETO的致白血病作用并非如此简单，有报道发现在U937细胞系中过表达AML1-ETO融合蛋白导致细胞生长停滞并发生凋亡[17]。使用Knock-in或转基因技术在小鼠中表达融合蛋白AML1-ETO后，会导致小鼠发生骨髓增生的紊乱，但并没有白血病的发生[18]。因此单纯的t(8;21)基因融合事件，产生融合蛋白AML1-ETO在白血病的发生中仅仅起着始动作用或只是上游或中游事件，染色体t(8;21)易位增加了基因组的不稳定性，可能使得基因组发生二次突变或二次打击事件，加剧了AML1-ETO造成造血系统紊乱，最终导致急性白血病的发生。

2.1c-kit基因突变 C-Kit为Ⅲ型酪氨酸激酶家族成员之一。临床数据表明，60%-80%的AML病人存在C-Kit的高表达，12.8%-46.8%的M2型AML病人存在c-kit基因的点突变[19]。在U937细胞中诱导表达AML1-ETO可以显著上调C-Kit的mRNA和蛋白水平，导致C-Kit的活化，这可以解释为什么在t(8;21)AML病人C-Kit的表达比其他白血病病人高出81.3%。这些现象可以得出这样的推断：t(8;21)阳性白血病的发生是分阶段进行的：先是发生了t(8;21)基因融合产生融合蛋白AML1-ETO，融合蛋白的产生导致了酪氨酸激酶通路的异常活化，这可能是白血病发生的一次关键性的打击事件，引发了急性白血病的迅速发生[20]。

2.2AML1-ETO截短体的发现 Yan等[21]在研究融合蛋白AML1-ETO的小鼠白血病造病过程中发现了AML1-ETO的截短体，该截短体缺失了C-末端的NCoR/SMRT反应结构域，并发现在小鼠体内过表达这种截短体可以迅速诱导白血病的发生。Yan等[22]发现t(8;21)阳性病人中存在一种AML1-ETO截短体：AML1-ETO9a，该截短体是由于在ETO基因中存在一个额外外显子9a，这个外显子的存在也导致C-末端剪切，产生了575个氨基酸组成的AML1-ETO融合蛋白。AML1-ETO9a也可以诱导小鼠白血病的发生，而且共同过表达全长的AML1-ETO和AML1-ETO9a也迅速诱导小鼠白血病的发生。

2.3caspase-3对AML1-ETO剪切作用对细胞凋亡敏感性的影响 Wang等[23]发现从疏花毛萼香茶菜(Isodoneriocalyx)植物中提取的萜类化合物eriocalyxin B可以显著诱导t(8;21)白血病细胞凋亡，并通过caspase-3 降解融合蛋白AML1-ETO。Zhou等[24]发现冬凌草甲素也可以诱导t(8;21)白血病细胞凋亡，在U937细胞中过表达AML1-ETO会增加细胞对冬凌草甲素诱导的凋亡敏感性。冬凌草甲素主要也是通过caspase-3对AML1-ETO剪切，其剪切位点是第188位氨基酸。Lu等[1]在研究caspase-3对AML1-ETO的剪切在白血病细胞凋亡中的作用时发现，将AML1-ETO的caspase-3靶位点第188位和368位天冬氨酸突变为丙氨酸后，表达AML1-ETO的细胞对凋亡敏感性完全消失。

3 结语

综上所述，融合蛋白AML-ETO 并非是通过单一通路导致白血病的发生，它的作用可能是通过多方面、多因素、多步骤的影响，或者类似于信号通路级联放大作用，从而触动急性白血病的猝发。但染色体易位产生融合基因AML1-ETO是白血病发生的一个重要始动因素，没有它也就没有下游基因或染色体改变事件，因而也不会有白血病的发生。当然也不排除可能在发生染色体易位前基因组已经发生了一些目前我们尚未发现的基因损伤或改变事件，引发了t(8;21)的染色体易位并伴随发生染色体的其它重要基因突变事件，遂导致了白血病的发生，这也可以用来解释为什么将体外重组的融合基因AML1-ETO转导到小鼠体内并不能导致白血病的发生。由此可见，融合蛋白AML1-ETO导致白血病发生的机制十分复杂，有待于我们进一步深入研究。

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BiologicalfunctionandcancerogenicmechanismofAML1-ETOfusionprotein

LIU Xiao-xiao1,2, ZHANG Bo1, ZHAO Qian1

(1DepartmentofPathophysiology,ShanghaiJiaotongUniuersitySchoolofMedicine(SJTU-SM);2InstituteofHealthSciences,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences/SJTU-SM,Shanghai200025,China.E-mail:qzhao@shsmu.edu.cn)

AML1-ETO fusion protein is the product of (8; 21) translocation in M2 type acute myelocytic leukemia (AML). As a transcription repressor, AML1-ETO can block the differentiation of hematopoietic cells by repressing the expression of some important hematopoiesis-related transcription factors. Recent results indicate that the fusion protein also induces the epigenetic silencing of some target genes, resulting in the delay of hematopoietic maturation. Moreover, AML1-ETO promotes the proliferation of hematopoietic stem cells through up-regulating the expression of Jagged1 and miR-24. Meanwhile, a panel of results in the pathogenesis of AML1-ETO show that the expression of AML1-ETO alone can not induce AML. The secondary events or hits likec-kitgene mutation and the AML1-ETO9a truncation play an important role in leukemogenesis of AML1-ETO-positive cells.

AML1-ETO融合蛋白; 转录阻遏; 造血干细胞; 二次打击事件

AML1-ETO fusion protein; Transcription repressor; Hematopoietic stem cells; Secondary hits

R363

A

1000-4718(2011)03-0603-04

2010-06-13

2010-11-16

国家自然科学基金资助项目(No.30870979)；上海科委基础研究重点资助项目(No.08JC1413500)

△通讯作者 Tel：021-64154900； E-mail：qzhao@shsmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.037