结核分枝杆菌L型研究现状与兽医临床＊

2011-02-11于守平钱爱东单晓枫叶丽萍

中国人兽共患病学报 2011年3期

于守平,钱爱东,单晓枫,叶丽萍

细菌L型(bacterial L-forms)是细菌在体内外受到各种直接或间接损伤细胞壁的理化和生物因素的影响,其细胞壁受到破坏或细胞壁的合成受阻而转化成一种细胞壁缺失或缺陷的细菌(cell Wall-deficeint bacteria,CWDB)[1]。结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)也同其它细菌一样,在干扰细胞壁合成或破坏细胞壁结构的因素作用下以及在自然生长繁殖的过程中,发生细胞壁缺陷形成L型(MTB-L)。也有学者认为,细胞壁缺陷是结核分枝杆菌生命活动周期的一个环节[2-3]。在人医临床中结核分枝杆菌L型现已引起高度重视,很多大型医院已开展结核杆菌L型的检测,吴凤霞[4]等报道,对结核病人标本进行L型检测,其检出率达28.7%,在兽医临床上结核菌L型目前还未见报道,但其潜在的危害性应引起足够的重视。结核分枝杆菌根据致病性可分为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌,这四种结核分枝杆菌可相互感染[5]。研究发现牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组的同源性为99.95%,资料统计有10%～15%的结核病患者是由牛分枝杆菌引起的,有的地区儿童感染牛分枝杆菌高达33%[6-8]。目前对牛结核病的控制方法主要实施“检验-扑杀”政策,但由于结核分枝杆菌在细胞壁缺失的情况下,其细菌的多种生物学性状发生改变,易造成细菌学检查假阴性的结果,加上临床症状不典型,皮内变态反应(PPD)减弱,带菌牛的 PPD试验呈阴性,在不同程度上影响了对牛结核病的诊断,使带菌牛可长期潜伏在健康牛群中,在牛抵抗力降低的情况下L型可大量繁殖或恢复成原菌形成新的传染源,因此加强对牛分枝杆菌L型的检测,提高牛结核病的细菌学诊断率,对根除牛结核病具有重要的作用。

1 结核菌L型的形成机制

结核菌L型的形成可以是自发形成,也可以通过外界物理、化学及生物因素诱导产生。分枝杆菌L型最早由Sato等诱导成功[9],他们应用甘氨酸加溶菌酶对生长迅速的无毒分枝杆菌进行诱导而获得。甘氨酸的诱导作用在于它有替代肽聚糖上丙氨酸的作用,阻碍了肽聚糖的交联,除甘氨酸外蛋氨酸与苏氨酸也有类似作用。Willett与 Tha-coro应用溶菌酶加入家兔腹腔巨噬细胞均成功诱导结核分枝杆菌成L型[10]。一般认为诱导结核菌变为L型有如下因素[11-12]:(1)使细菌DNA发生改变的因素,如紫外线、人的胆汁、尿素、亚硝基胍类;(2)直接破坏细胞壁结构的因素,如溶菌酶、噬菌体等。(3)干扰细胞壁合成的因素包括:作用于肽聚糖多肽链结构,如青霉素、头孢菌素及某些氨基酸(甘氨酸作用最佳);作用于肽聚糖多糖链结构,如万古霉素;作用于细胞壁上其他组分,如异烟肼等。(4)宿主体内的某些免疫因素,如抗体、补体、吞噬细胞等。

2 结核菌L型的生物学特性

结核菌变为L型后,其生物学特性与原菌有明显的不同。(1)培养特性:由于细菌细胞壁的缺陷,L型不能在普通的结核菌培养基上生长,而要在高渗培养基上生长,国内外报道的培养基有胰胨大豆蛋白胨琼脂培养基(TSA-L培养基),改良胰胨大豆蛋白胨琼脂培养基(改良 TSA-L培养基)以及L型液体培养基(92-3 TBL)[13]。也有文献报道,结核菌L型能够在苏通培养基、肝消化液等不含渗透压稳定剂的非高渗培养基内良好生长繁殖和传代培养[14-15]。(2)菌体形态及染色特性[16-17]:细胞壁的缺失使菌体不能维持正常的形态,呈高度多形性,可呈现大小不等的圆球体(coccoid forms)、巨型体(large body)、丝状体 (filamentous forms)、原生小体和棒状体等;结核菌变为L型后,其染色特性与细胞壁的缺失程度有关,一般来说细胞壁部分缺失的结核杆菌L型可仍然保留革兰氏染色阳性和抗酸染色阳性的特征,但细胞壁完全缺失的结核分枝杆菌L型则通常为革兰氏染色阴性和抗酸染色阴性。不论是细胞壁完全缺失还是部分缺失的结核杆菌L型,其染色特性均受到菌细胞的代谢活性、培养基条件等因素影响而表现为不规则现象。(3)滤过性[18]:结核杆菌L型在电子显微镜下通常可见直径小于0.1μm的菌体细胞,其大小与中等大小的病毒相似,细胞壁的缺陷使细菌的可塑性增强,使其具有一定的可滤过性,能够通过0.22μm的除菌滤膜。母体血液中L型细菌可通过绒毛上较大的微孔,或通过微绒毛刷状缘的胞饮作用进入胎儿血液循环,从理论上支持结核分枝杆菌L型母婴传播的可能性。

3 结核菌L型致病性及特点

一般认为结核分枝杆菌细胞壁成分与其病原性有关,因此关于结核菌L型的致病性很多学者的观点也各不相同。

有学者认为,结核菌L型本身没有致病性,但恢复为原菌后仍可致病。Ratman[19]等用动物实验证明结核菌L型本身不引起皮肤迟发性超敏反应,也不引起结核的病理损害,但可以在体内长期存在,并在一定条件下恢复为原菌而导致结核病的发生。但大多数学者认为结核菌L型本身就具有致病性,并用大量的实验证明了这一观点。朱明利[20]等用牛型分枝杆菌L型经尾静脉接种小鼠,再于第13d、21d、36d、56d、73d 各注射 1 次 ,每次 0.2mL,100d后处死全部小鼠,病理剖检可见小鼠主要脏器有间质性炎症和多个脏器的增生;病原学检查可见小鼠脏器有典型的少量抗酸杆菌和大量的分枝杆菌L型。用牛型分枝杆菌接种的母鼠,可发现初生子鼠有灶性淋巴细胞浸润、畸形、肝小胆管瘤样增生等病理学现象,说明结核分枝杆菌L型可引起间质性炎症并通过垂直感染影响胎儿。马筱玲[21]等将结核菌L型菌液,经腹股沟皮下感染豚鼠,注射常规量0.05mg组豚鼠110d仍不发病,注射2.5mg组豚鼠60～90d发病,剖检可见豚鼠支气管旁淋巴结肿大,内有干酪样坏死物,且各脏器表面有出血点,肝、脾、肾等脏器有轻度的间质性炎症的表现,未见典型的结核结节形成,表明结核分枝杆菌L型毒力比原菌毒力弱,但仍具有致病性。结核结节形成与干酪样坏死是结核病在病理学上的特征性变化,但结核杆菌L型感染机体后,未形成典型的结核结节,这与L型细菌细胞壁缺损有关。结核结节的形成是由于结核菌在体内被巨噬细胞吞噬后,细菌细胞壁中的脂质刺激巨噬细胞增生,并转变为类上皮细胞,类上皮细胞再融合或分裂形成郎罕氏巨细胞,由类上皮细胞、郎罕氏巨细胞、局部聚集的淋巴细胞和纤维母细胞一起构成结核结节。结核菌L型表面脂质缺损,是感染动物后病灶中无结节形成的主要原因[22]。

4 结核核菌L型的遗传学特征

文献[23-25]报道结核分枝杆菌变为L型后其多种遗传特征可发生改变,这可能与细胞壁缺陷导致菌细胞染色体核苷酸片段丢失或基因重排有关。王豫萍[26]等对结核杆菌稳定L型纯培养物的染色体DNA特异性聚合酶链反应(PCR)扩增产物进行产物单链构象多态性(SSCP)分析显示,稳定L型的染色体DNA保留了与其亲代细菌型一致的主要带型,但也显示出少数不同于其亲代细菌型的DNA条带,表明结核分枝杆菌稳定L型可保留与其亲代细菌型一致的特异性染色体基因,但也发生了染色体基因的点突变。王和[27]研究发现,异烟肼、利福平等抗结核药物诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型的2-5代培养物仍保留着与亲代相同的扩增产物,但经多次传代(一般5代以上)后可发生染色体基因的突变,即在特异性PCR检测中出现与其亲代细菌型有差异的产物,这可能与稳定L型难以自发返祖有关,但此结果和结论仍有待进一步证实。

牛结核病(Bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分枝杆菌(M.tuberculosis)引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病,研究发现牛结核中有7%系结核分枝杆菌感染,而结核病人中10%～15%是由牛分枝杆菌感染,其中有15%以上的病人是通过饮用了患结核病牛的牛奶而感染的。早在1960年世界卫生组织专家委员会第七次会议中指出:“在那些还存在牛结核病的国家中,人类始终受到它的威胁,除非着手扑灭牛结核病,否则人类结核病的控制是不会成功的”[28]。由此可见,牛结核病不仅严重影响了畜牧业的持续发展,而且还威胁着人类的身心健康。目前牛结核病的诊断方法有细菌学检测方法(涂片镜检,细菌分离培养,动物实验等)、免疫学检测方法(提纯结核菌素皮内变态反应,血清学诊断技术)和分子生物学检测方法,由于分子生物学检测技术需要较先进的仪器设备,技术相对复杂,对实验条件和操作人员的要求较高,现阶段还很难在生产实践中普遍推广,而细菌学和提纯结核菌素皮内变态反应(PPD)由于所需材料及设备较为简单,操作方法简便,是目前兽医临床上用于检测结核分枝杆菌较为常用的方法[29-30]。由于结核分枝杆菌L型细胞壁不完整,细胞壁上缺乏分枝菌酸和磷脂,抗酸染色多为阴性,另外菌体形态及培养特性也发生改变,常规的细菌学检测很难检出;加之皮内变态反应(PPD)减弱,带菌牛的PPD试验常呈阴性,也影响患病牛的检出率。另外,由于结核杆菌L型感染引起的症状不典型或表现为非特异性炎症,导致临床和实验室诊断困难而发生漏诊和误诊,形成潜在的带菌者。要彻底根除结核病,必须从根本上消灭结核杆菌,临床上应对有进行性消瘦、咳嗽、慢性乳房炎、顽固性下痢、体表淋巴结肿胀的牛,采取其病灶、痰、尿粪、乳及其他分泌物进行抹片检查及结核杆菌L型的分离培养,同时对疑似牛进行皮内变态反应(PPD)试验,可充分提高带菌牛的检出率,控制牛结核病的关键是消灭传染源,因此开展结核分枝杆菌L型检测至关重要。

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