新城疫病毒抗肿瘤基因的研究进展＊

刘进军,刘开扬,王 静

肿瘤的发生与发展是一个多因素、多阶段、多基因的复杂变化过程。传统的肿瘤手术治疗只能去除原发病灶,不能从根本上杜绝其再生与繁殖;放化疗虽能杀灭肿瘤细胞,但也使大量正常组织细胞受到严重损伤。随着分子生物学、免疫学及病原生物学的发展,特别是新城疫病毒(NDV)溶瘤研究的不断深入,为控制肿瘤提供了新的思路。为了选择最佳的溶瘤效果,或者有针对性的让其表达“治疗性蛋白质”,不同毒株型的NDV完全测序成为发展更有效溶瘤研究的基础。新城疫病毒是禽副粘病毒 I型(APMV-I)的成员,属于副粘病毒科腮腺炎病毒属,成熟的病毒粒子一般为圆形,直径为120 nm～300 nm。病毒粒子是具有包膜的 RNA病毒,其核衣壳直径17nm～18 nm呈螺旋对称,由单负股RNA及与其相连的蛋白质NP组成。包膜为脂质双层膜,脂质膜内衬有一层特殊的基质蛋白M。包膜上附有长约8nm～12nm的糖蛋白(F和 HN)刺突。NDV的基因组结构为 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,分别编码6种结构蛋白,即核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrixprotein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素-神经氨酸(Haemagglutininneuraminidase,HN)和大蛋白(Large protein,L)。F、HN蛋白是构成NDV致病性的分子基础,其中HN蛋白也是抗肿瘤研究的热点;而F蛋白在鉴定NDV致病性中起主要决定作用。目前研究发现NDV具有很强的非特异免疫刺激作用,能刺激宿主免疫系统产生细胞因子,特别是干扰素,间接地增强CTL细胞的细胞毒作用;另一方面它可以帮助抗原提呈细胞(APC)提呈抗原,增强肿瘤细胞的免疫原性等。为了更好的研究其抗肿瘤的临床价值,现将病毒基因组特点及溶瘤主要机制总结如下。

1 病毒基因组特点

1.1 新城疫病毒的基因组为一条单股、负链、不分节段的 RNA。经典毒株的基因组长度均为15 186bp[1],是所有副黏病毒科成员中最小的。最近发现了全长为15 198bp[2]的毒株,其增加的核酸序列对研究毒性和分类具有重要意义。NDV基因组都有相似的起始序列及终止序列,起始序列为ACGGGTAGA(G)A,终止序列为 TTA(A)GA6-7。基因组中引导序列及尾随序列是其重要的调控区,在病毒RNA的复制及转录过程中起重要的调节作用。NDV基因组为6的倍数,而且这种6碱基规对NDV的复制非常重要。NDV基因转录出的各种mRNA均在3′端具有poly(A)尾和在5′端有帽子结构。病毒基因组中NP-P基因间隔区有1个或2个核苷酸,P-M和M-F基因间隔区有1个核苷酸,F-HN和 HN-L基因间隔区分别为17bp和34bp,这些间隔区为我们研究NDV每种蛋白的功能提供了先决条件。

1.2 病毒基因组编码及其蛋白的功能

1.2.1 核蛋白(NP) NP基因长 1 746bp或1 747bp,编码489个氨基酸,其5′非编码区插入6个核苷酸(CTC CCT/CCC CTC/TCC CCA/TCC CCA/CTC CCA等),此特征在种系进化分析中属于Ⅴ～Ⅵ基因型[2]。NP是NDV核衣壳的主要结构蛋白质,与病毒 RNA共同组成核糖核蛋白(RNP)。每个病毒粒子含有1 600个～2 000个NP单体,抗原性稳定,其抗体无中和病毒的能力。NP与F、HN基因表达的蛋白能够与肿瘤细胞的癌基因或其调节基因结合阻止癌基因的表达,从而抑制肿瘤生长或使肿瘤细胞逆转为正常细胞;同时可以引起了肿瘤细胞的凋亡。

1.2.2 磷蛋白(P) P基因 ORF长 1 188～1 451bp,编码395个氨基酸。P蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶的两个亚单位之一,也是NP蛋白的分子伴侣,它可以阻止NP蛋白对非病毒 RNA及病毒mRNA的“非法”衣壳化[1]。

1.2.3 基质蛋白(M) M 基因长1 241bp,编码364个氨基酸,其246～263中有两个碱性氨基酸序列,此特征可作为核酸定位信号,利用 RT-PCR技术可用来初筛任何NDV[3]。基质M蛋白不仅对病毒起保护作用,而且通过与细胞膜、病毒糖蛋白的胞质区以及核衣壳的相互作用而参与病毒的装配过程。M蛋白还有抑制宿主细胞mRNA转录和蛋白质合成的作用,对于肿瘤细胞而言,M蛋白抑制了瘤细胞的增殖,促进其凋亡。

1.2.4 融合蛋白(F) F基因长1 792bp,编码553个氨基酸多肽F0,前体蛋白F0经蛋白水解后成为F1和 F2,此水解过程依赖于宿主细胞及NDV的株型。F0必须在裂解区(第112位至第117位氨基酸)的116位与117位氨基酸之间被裂解为F1和F2两条多肽后,才能使病毒粒子具有感染性及复制增值的能力。F蛋白位于病毒的包膜上,是病毒感染宿主细胞时穿入的一个重要成分。通过它完成病毒包膜与细胞膜的融合,使病毒穿过细胞膜而进入到细胞内进行复制,同时F蛋白还介导感染病毒的细胞和相邻细胞之间的融合,导致多核巨细胞或合胞体的产生。F蛋白决定NDV的致病性,且是主要的分毒型依据。强毒株型的F蛋白具有的特征是:F0蛋白裂解位点具有两对碱性氨基酸残基(112R/K-R-Q-R/K-R-F117)[2],这种结构决定其很强的致病性,而且此序列决定蛋白水解酶的普遍性,即感染和溶瘤的普遍性[4];相反,NDV的弱毒株的序列(112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117)[2]决定其感染受细胞类型所限制,仅能被呼吸道和消化道上皮分泌的胰酶样酶裂解,即感染和溶瘤的局限性,其 F0蛋白裂解位点仅具有两个单独的碱性氨基酸残基并且限制蛋白水解酶活性;而中等强度毒株型F0蛋白裂解为点可以具有两对碱性氨基酸残基,或单独的一个精氨酸和一个赖氨酸或一对精氨酸。这些在F基因序列上的不同决定着不同NDV毒株表型在分子生物学的鉴定和分群。基于系统进化分析法中部分F基因测序及酶切图谱特征,NDV株可以分为Ⅰ～Ⅸ基因型。每个有特定酶切图谱特征的基因型所包含的分离株,在地域或流行病学上相互关联。

1.2.5 血凝素-神经氨酸酶(HN) 不同的NDV毒株的 HN基因长度不同,主要有 1 713 bp、1 731 bp、1 848 bp三个亚型[5],该序列里有4个极保守的和1个相对保守的糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr),据报道糖基化对神经氨酸酶的作用是必要的;还有12个极保守的和1个相对保守的半胱氨酸残基[5],这些残基对 HN蛋白的成熟尤其是二聚体形成具有重要的作用,但与其毒力无关。HN是构成NDV包膜上较大的纤突样糖蛋白的主要成分,它兼有血凝素和神经氨酸酶两种活性。通过介导病毒与宿主细胞受体的吸附而在感染中起着重要作用,HN的血凝素成分负责识别易感细胞的含唾液酸的受体并吸附上去,神经氨酸酶则有分解和破坏受体的能力,并促进新生的病毒粒子从感染的细胞膜上释放。

1.2.6 大分子蛋白(L) L基因长6 615bp,编码2 204个氨基酸,是基因组中最保守的序列,其6个高度保守序列可用于鉴定Ⅰ型毒株NDV,如果联合M基因的RT-PCR就可以鉴定出Ⅰ和Ⅱ基因型[3]。L蛋白是病毒RNA聚合酶的两个亚单位之一,它与P蛋白形成的复合物具有完整的RNA聚合酶活性,参与RNA转录和复制的大部分酶的活性都存在于L上,如病毒 RNA多聚酶、mRNA加帽酶、poly(A)多聚酶和磷酸激酶等[4],这些酶并不能利用裸露的核酸作为模板,但能识别螺旋状且有NP缠绕的核衣壳[4]。

1.2.7 W及V蛋白 P基因在转录过程中会在其484位(AAAAA GG↓G)发生编辑现象而产生两个额外的蛋白质W及V,它们和P蛋白含有相同的N端,但是具有不同的C端,W及V蛋白N端编码区的变异发生在1-240氨基酸位点。W蛋白含有147～227个氨基酸,而V蛋白含有239个氨基酸。W和V是病毒复制的必需成分,但W基因可变性与毒力、基因型及流行年代无关[2]。

2 病毒的主要抗病毒机制

2.1.1 NDV的溶瘤机制 目前大多数的研究都集中在HN基因及其重组表达体抗肿瘤的亚临床试验中,但通过以上NDV基因组特点的介绍,我们发现:溶瘤作用是 HN和 F共同完成的,研究 F结构时发现,F和HN蛋白在细胞是否开始融合的关键部位互相制约,HN的球状头部结构(124位点-151位点)与F蛋白的 HRB中心部位密切结合,当 HN的球状头部结构与唾液酸受体接近时,HN的二聚体结构发生变化促使 F0裂解为有活性的 F,并输送融合蛋白肽段到细胞膜表面,此时细胞融合才能够发生[2]。形成多核巨细胞后细胞分裂停止,启动凋亡基因导致肿瘤细胞裂解死亡。同时研究发现,NP、F或 HN基因还可直接引起了肿瘤细胞的凋亡、NP和P基因抑制了肿瘤细胞端粒酶的活性、NP和M蛋白在肿瘤细胞内的表达,抑制了肿瘤细胞的RNA、DNA、蛋白质的合成及功能或改变了DNA复制的特性,肿瘤细胞因而发生裂解[6]。

2.1.2 宿主免疫力的提高机制 据Schirrmacher[7-8]等证明,用NDV修饰肿瘤细胞制备的瘤苗,可以诱发动物及病人产生全身性的抗肿瘤免疫应答,抵抗亲本肿瘤细胞株的攻击,延长肿瘤病人的生存期限。并且证明,NDV的抗肿瘤作用与NDV颗粒表面的糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(HN)的活性有关。HN所具有的神经氨酸酶活性,可以去除肿瘤细胞表面的唾液酸,从而增强了机体的免疫识别能力,提高了免疫细胞杀伤肿瘤细胞的作用[3]。据魏林报道,裸鼠注射 HN的重组载体对淋巴细胞,尤其是CTL细胞及N K细胞均存在较强的正向调节作用,对于打破肿瘤免疫逃逸状态,诱发抗肿瘤免疫都是十分有利的。

通过测定全基因组序列我们可以掌握NDV的基因型即其毒力强弱,选择出溶瘤效率最好的毒株型,同时还的考虑其致病基因型是否感染人,以及对正常细胞有无副作用,才能科学的利用F和 HN的基因序列靶向作用来治疗肿瘤。

[1]唐一鸣.新城疫病毒基因组与基因演化[J].动物医学进展,2005,26(10):1-4.

[2]Wei D,Yang B,Li Yl,et al.Characterization of the genome sequence of an oncolytic Newcastle disease virus strain Italien[J].Virus Research,2008(135):312-319.

[3]Mia Kim L,Suarez DL,Afonso CL,et al.Detection of a broad range of class I and II Newcastle disease viruses using a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay[J].Vet Diagn Invest,2008(20):414-425.

[4]Wise MG,Sellers HS,Alvarez R,et al.RNA-dependent RNA polymerase gene analysis of worldwide Newcastle disease virus isolates representing differentvirulence types and their phylogenetic relationship with other members of the paramyxoviridae[J].Virus Research 2004(104):71-80.

[5]李太元,金宁一,丁壮,等.新城疫病毒株基因的克隆和序列分析及与国外基因的同源性比较[J].中国生物制品学杂志,2001,14(2):68-71.

[6]于健,王立冬,姜万富,等.NP及 HN和F基因抗人喉癌的实验研究[J].临床耳鼻喉科杂志,2005,19(23)1082-1084.

[7]Schirrmacher V,Haas C,Bonifer R,et al.Human tumor cell modification by virus infection;an efficient and safe may to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastledisease virus[J].Gene Ther,1999,6(1):63-73.

[8]SchirrmacherV,Ahlert T,Heicappell R,et al.Successful application of non-oncogenic viruses for antimetastatic cancer immunotherapy[J].Cancer Rev,1986,5:19-49.