淋巴细胞微粒的形成及其活性

邱 倩, 赵 玲， 熊 玮△

(1第三军医大学附属西南医院呼吸内科, 重庆 400038；2解放军第十二医院妇产科, 新疆 喀什 830000)

淋巴细胞微粒的形成及其活性

邱 倩1, 赵 玲2， 熊 玮1△

(1第三军医大学附属西南医院呼吸内科, 重庆 400038；2解放军第十二医院妇产科, 新疆 喀什 830000)

淋巴细胞微粒； 免疫反应； 血管生成

淋巴细胞的主要生理功能是参与机体特异性的免疫应答及调节，可进一步分为T淋巴细胞、B淋巴细胞，分别执行细胞免疫功能和体液免疫功能。活化的淋巴细胞能够表达和释放多种细胞因子和蛋白等，同时，当淋巴细胞受刺激活化或凋亡时从浆膜上脱落成直径为0.05-1.00 μm的小囊泡颗粒，形成淋巴细胞微粒(lymphocyte-derived microparticles, LMPs)。LMPs含有多种特异性膜糖蛋白和生物学活性的受体，可通过与靶细胞的相互作用启动靶细胞的生物学效应。这些细小的微粒可通过调节一氧化氮(nitric oxide,NO)通路引起血管内皮细胞功能障碍。因此，在多种疾病中都可观测LMPs数目的改变，如动脉粥样硬化[1]、心肌缺血、糖尿病、先兆子痫[2]等。

1 细胞微粒的形成

目前对细胞微粒形成的认识主要限于体外分离或培养细胞的相关实验，体内参与微粒形成的机制尚未明确。

生理状况下，淋巴细胞可囊泡化产生少量的LMPs。但在疾病状态下，LMPs数量的明显增加，主要是淋巴细胞受激活剂活化或凋亡的结果。细胞膜骨架由肌动蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白、纽蛋白和踝蛋白等组成，是保证细胞膜结构稳定性的主要物质。细胞膜骨架分解是微粒形成的前提，细胞膜出芽和膜骨架重构最终形成微粒，但细胞膜和膜骨架的相互作用机制仍在探讨中 。

正常情况下，真核细胞的膜磷脂双分子层分布不对称。细胞膜外层主要由胆碱磷脂(鞘磷脂和卵磷脂)组成，而内层主要由氨基磷脂[磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)]组成。细胞通过消耗能量维持磷脂的不对称分布，这一过程由细胞膜上3种特殊的能量依赖酶共同调节：氨基磷脂特异性移位酶(flippase)、非特异性脂质翻转酶(floppase)和非特异性脂质爬行酶(scramblase)。前2种酶均为ATP依赖，后1种酶是Ca2+依赖。Flippase能迅速将PS和PE从细胞膜外层转运到细胞膜内层；而floppase能缓慢将膜脂质从细胞膜内层转运到细胞膜外层，scramblase允许膜脂质在膜磷脂双层之间任意移动。在生理性Ca2+浓度下,活性的flippase和floppase共同维持膜脂不对称分布的动态平衡,而scramblase处于失活状态。当细胞受刺激活化或凋亡时，胞外Ca2+内流或胞内Ca2+储存库的释放，使细胞溶质中的Ca2+浓度持续上升, floppase和scramblase被激活,而flippase活性则受到抑制，带负电的PS翻转暴露于细胞膜外层上，胞膜脂质双分子层的不对称分布被破坏。

而细胞膜磷脂不对称分布消失常伴随细胞膜出芽和脱落，形成分泌囊泡，出现微粒。这一过程被认为与PS外转引起膜内外张力变化有关。实验证明许多激活剂会破坏细胞膜磷脂质双分子层的非对称分布，导致微粒形成，如钙离子载体C5b-9、钙离子载体A23187、胶原和凝血酶。

此外，细胞活化或凋亡后，细胞溶质中Ca2+的浓度升高，并且呈现时间依赖。胞质中增加的Ca2+抑制磷酸酶，而激活钙蛋白酶和蛋白激酶使踝蛋白降解，最终导致支撑细胞膜的正常细胞骨架结构遭到破坏，失去细胞骨架支撑的这部分细胞膜形成小泡状结构而向外突出伸出伪足，变形脱落形成微粒。细胞外的Ca2+被乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)鳌合后阻断胞质中Ca2+的增加和细胞骨架蛋白的降解，可阻止细胞释放微粒。因此，胞质中Ca2+增加和细胞膜骨架降解是活化淋巴细胞释放LMPs的主要机制。

但是研究发现，并不是所有的微粒都包含有PS，这说明微粒的形成机制非常复杂，可能有多条胞内通路[3,4]。Sebbagh等[5]发现半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)和Rho(Ras homologous member)相关的卷曲蛋白激酶Ⅰ(Rho-associated coil ed-coilprotein kinaseⅠ，ROCKⅠ)参与了微粒的形成。生理状态下，Rho GTP酶类是细胞内调节细胞骨架肌动蛋白的信号分子，当其结合GTP后可向下游效应蛋白转导信号。丝氨酸-苏氨酸激酶的2种亚型(Rho相关的卷曲蛋白激酶Ⅰ、Ⅱ,ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ)被认为是Rho蛋白的效应器。ROCK蛋白被与GTP结合的Rho蛋白激活，促进肌球蛋白轻链的磷酸化，肌球蛋白ATP酶激活使肌球蛋白-肌动蛋白丝与细胞质膜连接，收缩力增加，细胞收缩[6]。而细胞凋亡时囊泡的形成与Rho蛋白无关，取决于ROCK。ROCK Ⅰ被caspase-3激活发挥细胞收缩效应，导致了细胞膜骨架结构紊乱[7]。因此，凋亡时微粒形成中ROCK Ⅰ和caspase-3共同参与介导了细胞膜骨架结构的重塑。

而细胞活化和凋亡释放的微粒，不但形成机制上不同，在大小、膜磷脂与蛋白质的组成以及生理功能上也有明显差异[8]；体内微粒的释放水平具有性别特异性，受月经周期[9]和昼夜节律的调节[10]。而体内和体外产生的微粒表型有差异，细节未明。

2 LMPs的组成及表面标记

LMPs反映来源细胞的状态(至少在体外)，带有淋巴细胞胞浆内容物和其表面标记。从血液中分离的微粒(包括LMPs)由60%的磷酸卵磷脂、20%的鞘磷脂、9%的PE和其余一些磷脂组成。但不是所有的微粒表面都含有PE和PS[11]。使用不同方法得到的LMPs，其成分和表面标记可有差异。虽然Miguet等[12]使用1-D联合LC-MS/MS的方法首次分析了T细胞来源的LMPs的蛋白组成，结果鉴定出390种蛋白，其中34%定位在质膜上，含有17种不同分化的造血集群。但是LMPs的化学组成仍然缺乏描述。同时，LMPs的蛋白组成也取决于亲代淋巴细胞活化的方式。通过T细胞受体激活的T细胞富含CD3ε和CD3ξ链，其释放的微粒也含有此表面标记，而伊屋诺霉素和盐酸甲氧激活产生的LMPs则没有[13]。一般来说，LMPs表面表达淋巴细胞膜表面抗原，主要是糖蛋白，如CD3、CD4、CD8和CD20[14]。但并不是LMPs能表达所有来源的细胞蛋白。例如：T细胞来源的LMPs并不表达CD28和CD45。

3 LMPs的生物学活性

LMPs作为细胞间传递生物信息的重要介质，有多种生物学活性，可作为细胞介质和促进细胞信号的转导和效能。

3.1调节免疫反应 LMPs可对巨噬细胞起作用，调节免疫反应。深入研究发现，来源于Jurket T细胞株能释放LMPs，LMPs被RAW264.7巨噬细胞吞噬，进而诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡，凋亡过程释放微粒，导致微粒数目进一步增加。这一过程是通过磷脂-花生四烯酸脂质途径实现的[15,16]。体外和体内研究已证实巨噬细胞对死亡和濒临死亡细胞的吞噬具有高效性。不同于坏死细胞被摄取后出现的病理过程，大量凋亡细胞被吞噬可抑制炎症反应引发抗炎效应[17]。而巨噬细胞可通过摄取继发坏死的细胞自身得到活化，从而分泌炎症介质，因此，如果大量凋亡的细胞不被及时清除出现继发性坏死时，将启动机体炎症应答引起炎症反应。

事实上，在一些自身免疫性病和慢性炎症疾病中就存在着对凋亡细胞吞噬的缺陷，而巨噬细胞的大量凋亡将进一步促进炎症的发生。最终，释放的LMPs导致了免疫抑制和微粒的自我扩增，引起机体的炎症状态反应。这说明微粒可作为一种新的炎症介质，微粒的释放和生物学活性为研究免疫调节提供了一种新思路。

促/抗炎因子的不平衡状态在慢性炎症疾病如多发性硬化症和类风湿性关节炎的病理发展中起重要作用。T细胞通过与人类单核巨噬细胞直接接触产生病理效应，包括介导促炎因子白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的上调，诱发慢性炎症;正常情况下，这种病理过程可被HDL相关的载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)特异性抑制。除了促炎因子外，通过直接接触激活的单核细胞也介导细胞因子抑制物的产生，如分泌型白细胞介素1受体抑制物(secretory interleukin 1 receptor antagonist protein，SIL-IRα)。同时，LMPs也可促进多种炎性介质释放与黏附分子表达，从而促进炎症反应。Scanu等[18]体外刺激T细胞产生LMPs，LMPs同样也可诱导人类单核细胞产生IL-1β、TNF和SIL-IRα，HDL可抑制IL-1β和TNF的产生，但对SIL-IRα无此作用，说明了HDL在LMPs非坏死性活化单核细胞上具有抗炎作用。T细胞激活后释放LMPs转移来源细胞表面分子，以细胞接触的方式参与单核细胞的活化，从而影响单核细胞的活性，这种活性不是通过在炎症位点与T细胞直接接触的形式获得的。

3.2调节血管张力 血管壁不是一个静止的器官，在生理或病理刺激下发生动态变化。血管壁主要由平滑肌细胞、内皮细胞和细胞外基质组成。许多全身及局部因子调节血管平滑肌细胞和内皮细胞的功能，影响这些细胞的反应性，进而调节血管反应性。收缩因子包括血管活性肽、血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、内皮素-1，刺激血管增生及收缩，提升血压；舒张血管因子：NO、前列环素(prostacyclin,PGI)、C型利钠肽和内皮源性超极化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)使血管扩张，从而降低血压 。而在微粒作用下血管的扩张程度将下降。LMPs可改变NO和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生与释放之间的平衡导致血管壁氧化应激增加，影响内皮细胞功能，诱导内皮功能失调[19]。Martin等[20]实验证明LMPs可减弱乙酰胆碱诱导的血管舒张，减少小鼠主动脉环NO的释放，增加其过氧化物的产生，这些效应具有时间依赖性；同时证明LMPs也可下调剪切力介导的内皮依赖性小鼠肠系膜小动脉的舒张功能。其作用都是通过LMPs下调内皮细胞一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和上调小窝蛋白(caveolin-1)的表达而抑制内皮细胞NO与PGI的合成,从而上调了血管张力[20]。

除此之外，LMPs还可直接作用于平滑肌细胞而影响血管收缩功能。此微粒通过Fas配体(Fas ligand,FasL)与平滑肌细胞上的Fas相结合，激活平滑肌细胞NF-κB，活化eNOS及环氧合酶-2(COX-2)，促进NO和PGI的生成，进而诱导鼠主动脉弓对血管扩张剂的低反应性和内皮细胞功能紊乱。

3.3调节血管生成 最近几年的研究发现微粒通过在细胞间传递生物信息来调节心血管系统的功能。由于产生LMPs的方式不同，LMPs在调节血管生成方面有抑制和促进双重效应。

① 抑制血管生成 Yang等[21]发现体外经放线菌D处理后产生的LMPs能强烈地抑制主动脉环毛细血管的萌芽，阻碍毛细血管样结构的形成，使血管增殖、迁移和修复受损。该作用与下调2型血管内皮生长因子受体和提高ROS产物有关。进一步研究发现，LMPs使NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)亚基gp91phox、p22phox和p47phox的表达增加，结果导致ROS和NOX衍生的超氧化物(O2-)生成增多，而ROS参与了损伤内皮细胞功能；同时，LMPs使受体CD36的抗血管生成蛋白表达显著增强，并下调了2型血管内皮生长因子受体及其下游信号转导的蛋白质(磷酸化ERK1/2)的水平，从而抑制了血管生成。Mostefai等[19]研究表明,LMPs通过PI3K途径降低NO的产生。培养的内皮细胞受这种微粒的处理后,NO产生减少,该效应与eNOS的抑制位点磷酸化增强和caveolin-1的过表达有关。NO在血管生成过程中发挥着重要的作用,其调节血管内皮生长因子介导的血管生成。LMPs使内皮细胞NO产生减少,最终导致血管生成受损。

因此，体外经放线菌素D处理后产生的LMPs通过PI3K激酶、黄质氧化酶和NADPH氧化酶途径激活内皮细胞通路与ROS和NO有关，ROS和NO共同参与了LMPs抑制血管生成方面的作用。

② 促进血管生成 最近研究发现激活或凋亡的人淋巴细胞产生的LMPs也能够增加促血管生成因子的表达如:血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、IL-1β以及细胞黏附分子(ICAM-1),促进血管生成[22]。Martinez等[23]证实了激活或凋亡的人淋巴细胞产生的LMPs表面携带有(sonic hedgehog,Shh)基因。Shh基因在脊椎动物胚胎组织形成中起着重要的作用，包括大脑、脊椎、中轴骨骼和四肢的形成[24]。Shh蛋白被证实是脊椎动物发育过程中组织形成所必需的胞外信号[25]，并能诱导巨核细胞的分化[23]。携带Shh基因的LMPs直接作用于内皮细胞，改善内皮细胞的功能，并通过直接激活Shh和PI3K通路使内皮细胞释放NO,介导局部缺血/再灌注来预防内皮细胞功能障碍的发生。此过程与NO通路有关的酶磷酸化使其表达发生改变和降低了ROS有关[26]；另外，Shh蛋白通过上调促血管生成因子家族的两大家族：VEGF和血管成形素间接促进血管生成。Soleti等[22]在体外用LMPs(Shh+)处理血管生成模型中的内皮细胞发现，微粒介导和增加了毛细血管样组织的形成,并且这些微粒调节细胞的增殖、黏附分子的表达和内皮细胞的迁移。q-PCR结果显示促血管生成因子：VEGF、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,HGF)和FLT-1的mRNA表达水平增加。通过连接后肢缺血小鼠的左股总动脉，发现LMPs(Shh+)通过激活eNOS和其它下游的促血管生成因子增加了小鼠后肢的血流灌注。这说明微粒(Shh+)在刺激新生血管生成方面发挥着有效的作用。

总之，刺激生成的方式不同，LMPs在调节血管生成方面发挥着不同的作用。如：放射菌素D、植物凝集素(PHA)等刺激和凋亡产生的LMPs作用不一致。浓度也可影响LMPs调节血管生成的作用。低浓度的LMPs可能促进血管生成，高浓度的LMPs可能起抑制作用。LMPs的促血管生成作用和其促进内皮细胞释放NO有关，而抗血管生成作用和氧化应激及降低了内皮细胞释放NO有关。

4 LMPs和临床疾病

4.1心血管疾病 LMPs在冠心病的发病机理中起着重要的作用，研究发现动脉粥样斑块中有LMPs的存在[1]。来源于心肌梗死体内的微粒可损伤内皮NO转导通路，说明微粒可能部分参与了这些患者存在的内皮功能失调的过程[27]。心肌梗死的新治疗方法就是通过降低缺血/再灌注损伤的负面影响，来防止坏死梗塞区的扩大并促进新生血管形成。动物模型实验表明建立侧支循环可达到这一目的。把生长因子直接注入缺血区域或把带有VEGF的质粒载体转入动脉可促进侧枝血管的形成[28]。实验表明静脉注射激活或凋亡的人淋巴细胞产生的LMPs(Shh+)可释放NO，从而改善内皮细胞功能。最近报道了Shh基因治疗可作为一种有效的治疗手段用来改善缺血或心梗模型的心肌功能，并能促进糖尿病伤口愈合[29]。因此，携带Shh的LMPs可作为一种不同于基因治疗的新的治疗方法，通过改善内皮细胞功能、促进新生血管形成干预心血管病病程。

4.2类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA) Combes等[30]首次指出微粒可能在RA中的作用与血栓形成有关。但是微粒的数目和疾病活动的关系尚不确定。尽管研究者使用相同的方法分离和鉴定微粒，但由于分组不同，患者存在着个体差异，不同的研究结果中患者体内微粒的来源及数目有较大变化。

Berckmans等[31]发现和其它类型的关节炎患者和健康对照组相比，RA患者血液中LMPs、单核细胞微粒、粒细胞微粒和红细胞微粒的水平均无显著差异，而关节腔滑液中微粒增高。其中T细胞来源的微粒、B细胞来源的微粒分别占微粒总数的20%-25%和低于10%。在一些患者的关节腔滑液的微粒中检测到组织因子，微粒通过因子Ⅶ依赖的机制诱导凝血酶形成，可能进一步促进了关节内纤维素的沉积。另一方面，微粒在RA中的活性与微粒对成纤维细胞的作用有关。Distler等[32]发现来源于Jurkat细胞的LMPs可以剂量依赖的方式诱导滑液中成纤维细胞MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白的合成(高达80倍)，而MMP-2、MMP-14、组织蛋白酶、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2和TIMP-3则无改变，说明LMPs对成纤维细胞MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13的上调具有特异性。同时，LMPs也可刺激促炎因子IL-6、IL-8、MCP-1和MCP-2的合成释放。这些细胞因子可吸引更多的炎症细胞迁移到关节内并激活微粒本身，导致更多的微粒释放，进一步反馈活化炎症细胞使炎症出现自我放大反应，导致骨和软骨的破坏。微粒激活成纤维细胞的具体机制未明，由于一些微粒包含核苷酸和其它核内分子，可能TLR参与了激活过程。通过IκB转染成纤维细胞和电迁移率分析，证实微粒诱导MMP的生成依赖于NF-κB通路，但与TNF-α和IL-1无关，表明LMPs诱导MMP和细胞因子释放可能与患者对生物靶向TNF-α和IL-1治疗的抵抗有关。

4.3糖尿病 目前威胁糖尿病病人生命最严重的病理为心血管病变，累及各种大血管和微血管病变是造成Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病发病和致死的主要原因。微血管病变常伴有微循环异常，引起肾脏病变、眼底病变等，严重者可造成肾功能衰竭和失明，是决定患者预后的主要因素,常见于各型糖尿病；而大血管病变主要和动脉粥样硬化、高血压、血脂障碍和肥胖等危险因素有关，常引起心、脑、肾严重并发症而致死，因此在2型糖尿病更常见。现已检测到糖尿病患者体内总微粒数量(包括LMPs)有明显增加[33]。和对照组相比,患者体内总Annexin-V阳性的微粒(包括LMPs)数量显著上升，且HbA1c相关微粒的凝血活性也显著增强，HbA1c参与了1型糖尿病糖蛋白失衡的病程。而2型糖尿病仅见总Annexin-V阳性的微粒增加。除了血凝素受体外，微粒表面还可携带黏附分子以结合血细胞或血管内皮，参与炎症信息的传递。白细胞来源的微粒可与内皮细胞相互作用诱导组织因子的表达。这说明各型糖尿病病理过程中激活释放微粒，反作用于血细胞和血管内皮细胞，加重细胞活化过程，恶化血管病变和疾病病程。

4.4其它 在其它各种生理和病理状态都可有过量的微粒生成。如：细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应、癌症、感染和正常或异常妊娠等。炎症状态下，体内微粒的释放量增加[34]。同损伤的细胞类似，微粒也能通过激活补体级联反应来启动炎症过程。识别单位C1q可结合来自凋亡Jurkat T细胞的LMPs，从而活化补体经典途径[35]。MPs表面有C3、C4的沉淀物可证实这一点。体内检测人类血浆中C1q阳性微粒量也同样可证明。补体经典途径早期成分的沉积能激活经典途径促进炎症反应。同时，在刺激炎症反应的机制中，微粒能释放花生四烯酸作用于靶细胞，增强炎症细胞的趋化性，并可诱导炎症因子的形成。LMPs也可通过诱导免疫活性细胞凋亡来发挥抗炎作用。Jodo等[36]发现细胞能释放表面携带FasL的微粒。与可溶性FasL和弱细胞毒性介质有关不同，微粒相关的的FasL的作用类似于杀伤性B细胞、T细胞的FasL的作用。已证实T细胞来源的LMPs能诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡，并促进凋亡中的巨噬细胞释放微粒[15]。这种促凋亡机制和炎症反应密切相关。但在恶性肿瘤中，来源于肿瘤细胞并携带FasL的微粒诱导杀伤性T细胞凋亡可导致肿瘤逃逸。HIV-1感染患者外周血液中也有来源于辅助T细胞的微粒的增加。

5 小结

LMPs作为淋巴细胞受刺激活化或凋亡后形成的细胞脱落物，循环血液中LMPs水平和性质可反映其来源淋巴细胞的功能状态，并发挥多种重要的生物学作用，参与许多临床疾病的病理生理过程，因此对LMPs的形成过程、产生机制、内部成分及其生物学活性的作用机制等的进一步研究都将成为今后深入探讨的热点。LMPs作为淋巴细胞活化或凋亡的标志物，如何将LMPs的各种作用运用于临床等都有待进一步解决。

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Formationandactivityoflymphocyte-derivedmicroparticles

QIU Qian1, ZHAO Ling2, XIONG Wei1

(1RespirationDepartmentofSouthwestHospitalAffiliatedtoTheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,TheTwelfthHospitalofPLA,Kashi830000,China.E-mail:xiongwei64@126.com)

Lymphocyte-derived microparticles (LMPs) are small membrane vesicles that are released upon activation or during apoptosis from lymphocytes.The LMPs were detected at elevated levels in the patients with inflammatory diseases, cardiovascular diseases or diabetes. In addition, LMPs are important mediators of transferring biological information and switching on the biological effects through their interaction with the target cells. Moreover, LMPs play completely distinct roles in different physiological and pathological conditions. This article describes the possible mechanism involved in the formation, composition, key biological activities and the relationship with diseases.

Lymphocyte-derived microparticles; Immune response; Angiogenesis

1000-4718(2011)04-0817-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.039

2010-07-19

2010-11-30

△通讯作者 Tel:023-68765316; E-mail: xiongwei64@126.com