角膜基质细胞的表型转化及其分子机制*

潘红卫, 李学晶， 徐锦堂， 陈妙姣， 马 荣

(暨南大学1医学院眼科研究室,2附属第一医院眼科,3医学院临床医学系，广东 广州 510632；4中国中医科学院眼科医院，北京 100040)

角膜基质细胞的表型转化及其分子机制*

潘红卫1，2△, 李学晶4， 徐锦堂1，2， 陈妙姣3， 马 荣3

(暨南大学1医学院眼科研究室,2附属第一医院眼科,3医学院临床医学系，广东 广州 510632；4中国中医科学院眼科医院，北京 100040)

角膜细胞;肌成纤维细胞; 表型转化

角膜瘢痕是继发于多种角膜疾病的病理性改变，是许多角膜疾病造成视力不同程度损害甚至丧失的直接原因，也是影响角膜屈光手术效果的重要因素。对于角膜损伤愈合后的角膜瘢痕,目前临床上主要治疗方法是穿透性或者板层角膜移植术，但因为角膜供体材料缺乏和经济原因，大量的患者无法得到手术治疗而最终丧失视力。近年来国外内相关研究证实了角膜基质细胞向肌成纤维细胞的表型转化在角膜瘢痕形成中的重要作用，下面就研究现状做一简要概述。

1 角膜基质细胞的表型

1.1角膜基质细胞的几种表型

①角膜基质细胞 角膜基质细胞(keratocyte)是正常角膜基质中的主要细胞成分。在角膜未受损伤的情况下，角膜基质细胞处于相对静止状态，细胞呈扁平多突起状，通过细胞突起顶部的缝隙连接与相邻细胞发生联系。角膜基质细胞最重要的作用是维持角膜基质中细胞外成分的稳定，一方面合成和分泌细胞外基质蛋白，主要包括胶原蛋白和糖蛋白等，另一方面产生分泌酶类以降解细胞外基质，使细胞外基质的合成与降解达到动态平衡。另外，角膜基质细胞对于维持细胞外胶原纤维的规则排列和分布具有重要调节作用，而后者正是角膜透明性的重要保障。角膜基质细胞终身保持损伤条件下的转化和增殖能力，被认为是具有类似干细胞的分化潜能。角膜基质细胞在发育上来源于颅脑神经嵴。Lwigale等[1]将角膜基质细胞加入到有神经嵴细胞存在的特殊培养系统中，发现角膜基质细胞形态发生变化，并向神经嵴细胞移行，在一定条件下可以分化成为角膜内皮和基质，以及肌肉和血管组织等，但是无法分化为神经细胞，这些说明角膜基质细胞不是终末分化细胞，而是具有一定方向的分化潜能。

②角膜成纤维母细胞 在角膜在受到各种损伤因素刺激后，原本处于静止状态的角膜基质细胞被激活，转变为修复表型(repair phenotype),通常称作角膜成纤维细胞(corneal fibroblast)。激活后的角膜成纤维细胞移行到受损伤的角膜基质附近，参与组织修复过程。与角膜基质细胞相比，成纤维细胞的细胞形态发生明显改变，由原来的扁平多突起状态转变成长梭形，与其它组织中的成纤维细胞相似，如皮肤成纤维细胞功能也发生显著变化，细胞合成和分泌细胞外基质的水平大大提高，包括各型胶原和糖基蛋白，另外，成纤维细胞可以合成较多的基质金属蛋白酶、纤维黏连蛋白和整合素等，而这些在角膜基质细胞的合成处于很低的水平。

③肌成纤维细胞 由角膜基质细胞激活而形成的成纤维细胞中，有一部分进一步转化成为肌成纤维细胞(myofibroblast)，其重要的标志就是平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的表达以及肌动蛋白纤维(F-actin)的形成。α-SMA的表达和F-actin的形成使肌成纤维细胞具有收缩特性，在损伤后可以促进愈合过程，具有一定积极意义。但是肌成纤维细胞对愈合也存在不利影响，它已经被证明是角膜损伤后透明度下降和瘢痕形成的重要因素[2]。对于维持角膜透明度有重要作用的蛋白如ALDH 3A1和TKT，在转化后的肌成纤维细胞表达明显下调或者不表达[3, 4]，而原本一些在角膜基质细胞不表达的蛋白，在肌成纤维细胞出现显著表达，这导致肌成纤维细胞本身透光性下降。另外，由于肌成纤维细胞的收缩特性，导致角膜表面的不规则，增加了光线的散射和折射，也降低了角膜的透明度。

1.2各种表型的细胞标志物

①Thy-1 也称CD90，是属于免疫球蛋白超家族的细胞表面糖蛋白,它表达于多种细胞,包括成纤维细胞、早期T细胞、B细胞以及CD34阳性骨髓细胞等。Pei等[5]的研究发现通过胶原酶消化得到的原代角膜基质细胞不表达，而在有血清或者转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)条件下培养后的角膜成纤维细胞和肌成纤维细胞则有明显表达。在未受损伤的角膜基质中也未检测到Thy-1的表达，说明Thy-1在角膜组织修复中可能发挥一定作用，并且可以作为区别角膜基质细胞与其修复表型的表面标志。

②ALDH3A1 在正常角膜组织，一些晶体蛋白包括醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH) 和酮糖移转酶(transketolase，TKT)有较高水平表达，并被认为与角膜透明性的维持有关。在Pei等[3]的研究中发现，角膜基质细胞转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞后，ALDH其中一个亚型ALDH3A1表达显著下降，TKT蛋白表达也比角膜基质细胞减少。

③视觉系统同源基因(visual system homeobox gene，VSX1) VSX1在人类主要表达于视网膜内核层，被认为与视网膜双极神经元的发育有关。另外，有研究发现VSX1变异与角膜营养不良和圆锥角膜有关。Barbaro等[6]的研究发现，在正常角膜基质和体外无血清培养条件下的角膜基质细胞检测不到VSX1的表达，而在受损伤的角膜基质和体外有血清培养条件诱导下角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化后，则出现VSX1的表达，这说明VSX1与角膜基质细胞表型转化密切相关，并可能参与了某些角膜疾病的发病过程，如圆锥角膜。

1.3各种细胞表型间的相互转化 角膜基质细胞在损伤因素诱导下活化成为成纤维细胞，而角膜基质细胞和成纤维细胞在各种细胞因子特别是TGF-β作用下还可以转化为肌成纤维细胞，这一细胞转化过程已经被许多研究证实。已经转化的成纤维细胞和肌成纤维细胞的结局如何呢？在动物损伤模型中证实，损伤愈合反应过程中出现的成纤维细胞和肌成纤维细胞会随着愈合过程的后期逐渐减少和消失。角膜基质细胞的活化和转化是否是一个不可逆的过程，以及角膜肌成纤维细胞是否是一种终末分化细胞？目前这方面研究较少，Maltseva等[7]在对体外培养的角膜肌成纤维细胞给予成纤维细胞生长因子和肝素的联合作用下，角膜肌成纤维细胞的比例显著下降而成纤维细胞的比例明显上升，该研究表明角膜肌成纤维细胞并不是一种终末分化细胞，在一定条件下角膜肌成纤维细胞可以逆向转化为成纤维细胞。这为角膜基质细胞表型的相关研究提出了新的思路，如果能够利用有效手段调节角膜基质细胞在不同表型之间的相互转化，将对角膜疾病治疗有重要应用价值。

2 角膜基质细胞表型转化的机制

2.1体内引起角膜基质细胞表型转化的因素 各种损伤因素导致的角膜上皮基底膜完整性的破坏是引起角膜基质细胞表型转化的重要启动因素。正常情况下，角膜表面泪液中和角膜上皮分泌产生的TGF-β等细胞因子无法通过上皮基底膜而进入角膜基质,在基底膜出现局部破坏后，TGF-β进入基质层,诱导角膜基质细胞开始转化。另外有研究[8]表明在房水TGF-β浓度升高或者角膜内皮层及内弹力层受损伤的情况下，来自房水中TGF-β也可以进入角膜基质，从而引起角膜基质细胞发生表型转化和细胞外基质的积累，造成角膜透明度下降。

2.2体外培养条件下角膜基质细胞表型转化的影响因素 膜基质细胞分离和体外培养的方法已经得到建立和完善，最常用的方法是通过机械分离角膜基质组织，利用胶原酶消化形成细胞悬液，然后接种到无血清的培养基中培养。为补偿无血清引起的营养物质缺乏，需要添加必要的物质如非必需氨基酸、维生素、丙酮酸钠等。无血清培养是保持角膜基质细胞表型所必须的，已有研究证实在有血清培养条件下，角膜基质细胞会发生与体内角膜损伤类似的细胞转化过程，成为肌成纤维细胞。无血清培养虽可以保持角膜基质细胞表型，但是一定程度上抑制了细胞增殖。有研究表明[9]，在无血清培养条件下，补充胰岛素可以促进细胞增殖并可以维持角膜基质细胞表型。

2.3多种细胞因子发挥重要作用

①TGF-β TGF-β是目前认为在角膜基质细胞表型转化中最重要的细胞因子。TGF-β主要有3种亚型，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。Carrington等[10]的研究表明TGF-β1是在角膜愈合反应中发挥最重要作用的一个亚型，它可以促进角膜基质细胞的增殖，并且是唯一可以诱导角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化的亚型，而它对上皮修复却有抑制作用。TGF-β2和TGF-β3对角膜上皮有促进增殖的作用，而抑制角膜基质细胞的增生。Huh等[11]的研究则显示TGF-β2是角膜愈合反应中诱导肌成纤维细胞形成的主要因子，p38MAPK通路参与这一作用。TGF-β诱导角膜基质细胞表型转化与Rho和ROCK信号通路有密切关系。Chen等[12]的研究发现TGF-β诱导角膜基质细胞出现α-SMA和tenascin-C的表达以及某些蛋白多糖如硫酸角质素等的表达下降，可以被Rho和ROCK信号通路阻断剂所抑制。TGF-β不仅是诱导肌成纤维细胞出现的重要因素，而且它对于维持已经转化的肌成纤维细胞的活性具有重要作用。Kaur等[13]的研究显示在体外培养的角膜肌成纤维细胞，IL-1可以诱导细胞凋亡，而TGF-β可以显著抑制IL-1的促凋亡作用。在体内角膜损伤后的愈合反应中，随着角膜上皮基底膜完整性的恢复，泪液及上皮细胞来源的TGF-β不再能够进入角膜基质，从而使基质中的TGF-β水平下降，已经形成的肌成纤维细胞逐渐消失。

②结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF) 在体内角膜上皮被擦伤或者进行PRK手术后，以及体外培养角膜基质细胞给予TGF-β刺激后，可以检测到角膜成纤维细胞表达CTGF[14]。CTGF是 TGF-β诱导肌成纤维细胞形成的必要条件，阻断CTGF可以抑制肌成纤维细胞的形成，但是CTGF单独作用并不能引起肌成纤维细胞的形成和胶原基质的收缩。因此，TGF-β可能是通过调节许多其它基因来共同发挥作用，而CTGF是其中之一[15]。

③血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF) 许多组织中的成纤维细胞可以通过自分泌PDGF共同参与TGF-β对细胞增殖的调节。在对角膜基质细胞的研究中发现[16]，阻断PDGF可以抑制TGF-β诱导的细胞内肌动纤维丝、纤维黏连蛋白原纤维、细胞间连接以及α-SMA表达，其抑制作用可达80%左右。

④上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF) EGF被证明可以引起角膜基质细胞从树突状形态转变为典型肌成纤维细胞的形态，并且表达α-SMA。EGF可以增强TGF-β诱导肌成纤维细胞和促进细胞移行能力，其作用可能是通过PI3K信号通路介导[17]。

⑤神经生长因子(nerve growth factor, NGF) NGF在角膜上皮、角膜基质细胞以及活化的角膜成纤维细胞均有表达。Micera等[18]的研究表明NGF可以诱导角膜成纤维细胞进一步转化成为肌成纤维细胞，并促进细胞移行、MMP-9分泌、胶原凝胶收缩，但对细胞增殖和胶原合成无影响。

2.4角膜基质细胞的表观遗传调控机制 表观遗传学是研究表观遗传变异的遗传学分支学科。表观遗传变异(epigenetic variation)是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化,并最终导致了表型的变化。决定表观遗传学过程的主要因素为DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控,这4个因素的相互关系以及它们如何共同来调节染色质结构还有待进一步研究。

最近已经有国内外学者开始利用表观遗传学研究手段来探索不同种类细胞在刺激因素作用下向肌成纤维细胞转化这一细胞生物学过程的内在机制。Mann等[19]发现静止状态肝脏星状细胞所不表达的DNA甲基化结合蛋白MeCP2在转化后的肝脏肌成纤维细胞中出现显著表达。Glenisson等[20]的研究表明组蛋白乙酰化修饰参与肌成纤维细胞转化过程的调节，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以抑制TGF-β诱导的皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。

关于角膜基质细胞的表型转化，最近也有学者进行表观遗传机制方面的研究。Horswill等[21]研究发现在角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化后，mapsin蛋白表达显著下降到无法检测的水平，在经过DNA甲基化转移酶抑制剂处理后，mapsin蛋白又重新出现表达，表明mapsin的表达受到启动子的甲基化和组蛋白甲基化调控。谢立信等[22]也研究发现组蛋白乙酰化修饰调控角膜基质细胞的表型转化，组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够抑制角膜基质细胞向肌成纤维细胞的转化，并且诱导已经形成的肌成纤维细胞衰老。目前对于角膜基质细胞表型转化的表观遗传机制研究尚处于起步阶段，需要进一步的研究来阐明表观遗传机制是如何影响到效应基因的表达。

2.5过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)调控角膜基质细胞表型转化 PPARs是一类属于核激素受体家族的配体激活转录因子，与维甲酸类、皮质激素类和甲状腺素受体有密切关系。目前已经发现有3种亚型，分别是PPARα、PPARβ (也被称为PPARδ)和 PPARγ，它们分布广泛，对代谢、细胞增殖及免疫反应具有重要的调节作用。PPARs最早被发现是因为它们在调节脂肪和糖代谢中具有重要作用。最近的研究表明PPARs对于组织损伤后修复反应具有重要调节作用，其中PPARγ在肾、肝、胰腺、肺以及神经组织等多种组织中具有显著的抑制纤维化和调控修复反应的作用[23-25]。

Saika等[26]通过碱烧伤建立角膜损伤动物模型，构建PPARγ腺病毒表达载体转入角膜组织，发现PPARγ高表达可以抑制单核细胞和巨噬细胞进入损伤部位角膜组织，阻止肌成纤维细胞的产生，降低损伤角膜组织中各种生长因子和基质金属蛋白酶的水平，显著缩短损伤角膜的愈合时间。我们的前期研究表明对于已经转化的角膜肌成纤维细胞，PPARγ受体激动剂可以通过抑制细胞的移行、抑制细胞引起的胶原收缩、减少细胞分泌MMPs等机制发挥抗纤维化作用[27]。

3 角膜基质细胞表型的调控手段

3.1针对细胞因子 目前对于角膜基质细胞表型调控的研究多集中在细胞因子水平，并且大部分还处于动物实验水平。Kaur等[28]发现在兔眼进行PRK术后角膜上皮尚未愈合的情况下，对角膜基质阻断PDGF的作用，术后1个月裂隙灯观察发现PDGF阻断后角膜haze与对照相比程度较轻，虽然差别并不显著，但是组织学观察发现，PDGF阻断可以显著减少角膜基质中α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数量。

Buhren等[29]发现TGF-β抗体可以显著抑制体外培养角膜基质细胞的转化，并且抑制猫眼PRK术后角膜基质内肌成纤维细胞的形成，并减轻haze的形成，对角膜上皮愈合无明显影响。

3.2药物 曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)，是一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，在多种组织中显示出抗TGF-β诱导的纤维化作用。Sharma等[30]研究发现TSA可以显著抑制TGF-β诱导角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化和细胞外基质的合成，在对兔PRK术后给予TSA可以减轻haze的形成。

SN50是核因子κB(nuclear factor-kappa B， NF-κB)的特异性抑制剂。Saika等[31]研究了SN50在角膜损伤愈合中的作用，他们通过碱烧伤建立角膜损伤模型，局部给予SN50直到伤后12 d，通过组织学和免疫学检测发现角膜基质中肌成纤维细胞的形成，巨噬细胞的浸润，基质金属蛋白酶的活性，各种细胞因子水平以及上皮和基底膜的缺损均显著下降，进一步的机制研究表明SN50可能是通过TNF-α/JNK信号发挥作用。

3.3基因转染 Decorin是一种富含亮氨酸的蛋白多糖，是TGF-β的天然抑制剂。有研究[32]表明通过将decorin表达载体转入角膜基质细胞和成纤维细胞，可以阻止TGF-β诱导肌成纤维细胞的形成，以及细胞外基质成分的合成。

3.4生物材料 体外培养的生物材料表面对角膜基质细胞表型也具有调控作用。Chen等[33]研究发现角膜基质细胞培养在壳聚糖(chitosan)包被的材料表面时，在含有10%血清培养条件下可以形成细胞球团，通过扫描电镜观察，球团内的细胞相互紧密连接，呈现典型的树突样基质细胞形态，但是这些细胞没有表现增殖活性。

3.5其它调控手段 Xing等[34]发现通过腺苷酸环化酶激动剂FSK的作用提高cAMP水平可以抑制TGF-β诱导的角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化，这一作用与Smad和MAPK信号通路无关，而是通过抑制RhoA的活性实现的。另外该研究小组还发现低氧培养条件以相似的机制抑制TGF-β诱导的角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化[35]。

4 展望

综上所述，角膜基质细胞的表型转化在角膜损伤后瘢痕形成中的重要作用已经得到许多研究的确认。因此，深入研究角膜基质细胞表型转化的分子机制并且探索有效的调节手段是防治角膜损伤后瘢痕形成的研究方向。

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Phenotypetransformationofkeratocytesandthemolecularmechanism

PAN Hong-wei1,2, LI Xue-jing4, XU Jin-tang1,2, CHEN Miao-jiao3, MA Rong3

(1DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine,2DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital,3DepartmentofClinicalMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;4EyeHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalScience,Beijing100040,China.E-mail:panhongwei@hotmail.com)

Keratocytes, the major cells in corneal stroma, are relatively quiescent and responsible for the maintenance of the extracellular matrix and transparency of the cornea. Under the condition of injury, the keratocytes are activated and transformed to fibroblast and myofibroblast, characterized by alteration in cell morphology, metabolism and functions. This phenotype transformation of keratocytes is closely associated with the corneal scar formation, and its molecular mechanisms have been intensively studied in recent years. Many markers have been found to identify the different phenotypes of keratocytes. Destruction of corneal epithelium, growth factors, PPARγ and epigenetic mechanism are involved in the generation of myofibroblast.

Keratocytes; Myofibroblast; Phenotype transformation

1000-4718(2011)04-0803-05

R772

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.036

2010-10-11

2011-01-10

国家自然科学基金资助项目(No.81000368)；广东省医学科研基金资助项目(No.B2008091);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(No.21609315);暨南大学本科生科技创新工程资助项目(No.cx09100)

△通讯作者 Tel：020-85226413; E-mail: panhongwei@hotmail.com