细胞共培养技术的研究进展

张 茜，金若敏

(上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海 201203)

在药理学和毒理学实验中，最常用的方法有两种，整体动物在体实验和体外实验，其中体外实验包括对动物离体器官、离体组织、细胞和病原体的实验等［1］。

采用细胞进行体外实验时涉及细胞培养技术，细胞培养是将细胞置于体外条件下进行生长和繁殖，由于培养物是单个细胞或细胞群，所以在培养的过程中细胞不再形成组织(动物)。细胞实验具有可直接观察活细胞的形态结构和生命活动、直接观察细胞的变化、易于提供大量生物性状相似的实验对象以及耗资少等优点。虽然过程中细胞独立生存于人工模拟的体内环境，但该环境与真实的体内环境相比仍有很大差异，因而细胞实验结果不能完全等同于在体实验结果。为了能够建立更类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖［2］，20世纪80年代后期，人们在细胞培养技术的基础上发展出了细胞共培养技术。细胞共培养技术是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中的技术，由于其具有更好地反映体内环境的优点，所以这种方法被广泛应用于现代细胞研究中。本文就细胞共培养的方法及其在离体实验中的作用作一综述。

1 细胞共培养的方法

目前，细胞共培养技术最多应用于骨细胞和神经细胞。细胞共培养体系主要通过两种方法建立:① 直接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触，例如朱强等［3］将大鼠肝细胞与Kupffer细胞按6∶1直接接种于6孔培养板内，观察不同情况下肝细胞生存时间和形态;于聪慧等［4］在研究肝细胞、胰岛细胞与储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响时，先将储脂细胞加入培养瓶中，培养条件及培养液同肝细胞，培养48h后将培养液弃去，再加入肝细胞和胰岛细胞，3种细胞的培养比例为4000∶200∶1;王金晶等［5］将肝窦血管内皮细胞种植在包被胶原的24孔培养板中，待细胞铺展成片后，将一部分肝实质细胞植于其上的共培养体系。②间接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触，例如高毅等［6］将分别接种于盖玻片上的人骨髓来源多能成体祖细胞在与人肝细胞系L-O2细胞，按照各1∶1共置于培养皿中，来观察培养液共通时肝细胞特征性表型表达的变化情况;卢晓露等［7］利用transwell小室(又称Millicell插入式细胞培养皿)，将肾小管上皮细胞接种于6孔共培养板的上室滤膜上，加入药物，同时将肾间质成纤维细胞接种于另一6孔共培养板的下室进行培养，一段时间后放入经药物刺激的上室，将2种细胞共培养;方静等［8］将肾小管上皮细胞接种于预先放入了盖玻片的24孔板中，培养一定时间，同时将成纤维细胞种入24孔板中，培养一段时间后放入不锈钢筛网支架，再放入种有肾小管上皮细胞的盖玻片。

2 共培养体系在离体实验中的作用

2.1 诱导细胞向另一种细胞分化

在细胞共培养体系中，辅助细胞可以诱导目的细胞向辅助细胞或向另一种细胞分化。韩翠萍等［9］将骨髓间充质干细胞与肝细胞进行共培养，同时采用流式细胞仪检测贴壁干细胞的表面标志，倒置相差显微镜观察共培养后细胞形态的变化，RT-PCR法检测肝细胞表面抗原mRNA的表达。结果发现，随着共培养时间的延长，越来越多的干细胞从长梭形变为与肝细胞形态相似的多角形，并且细胞角蛋白19 mRNA和白蛋白mRNA开始表达，甲胎蛋白mRNA表达减弱。高大宽等［10］用脂肪干细胞和神经干细胞共培养，8～12 d后发现共培养组出现大量成熟神经元，神经干细胞分化为神经元的百分率约为21%，与对照组分化率仅有4%相比有显著差异，表明脂肪干细胞在体外能够促进神经干细胞向神经元转化。高毅等［6］将人骨髓来源多能成体祖细胞在与人肝细胞系L-O2细胞间接共同培养后发现，人肝细胞系L-O2能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化。

2.2 诱导细胞自身的分化

共培养体系中的辅助细胞增强目的细胞的分化能力。李全修等［11］通过建立骨髓间充质干细胞和髓核细胞分层共培养模型，观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响。结果表明，两种细胞共同培养后，能使髓核细胞的分化增殖显著增加，其特征性物质表达升高。解杰等［12］利用藻酸盐模拟骨髓微环境，将骨髓间充质干细胞与前列腺癌细胞在藻酸钙中混合培养后发现，有干细胞存在共培养的三维藻酸钙微环境中，前列腺癌细胞的成簇速度、数量及成瘤率均升高，提示在藻酸钙微球环境中，骨髓基质干细胞有利于前列腺癌细胞增殖及成簇性发展;朱彤等［13］在研究共培养系统中巨噬细胞对大鼠视网膜神经节细胞存活和轴突再生的影响后发现，巨噬细胞可明显促进共培养体系中视网膜神经节细胞轴突的生长。

2.3 维持细胞的功能和活力

共培养体系中的辅助细胞可以维持目的细胞的基本功能。肝细胞实验主要用于药效实验、毒性实验和建立生物人工肝脏，其中在建立生物人工肝时只要给予适当的刺激就能使肝细胞快速增长，最后成为肝组织，但是在此过程中最为重要的是要使生成的肝组织在很长一段时间都能够维持其功能不变，而肝细胞本身具有的短期存活率和高速分化的特点使得人工肝的构建困难重重，但是Bhandari等［14］采用共培养技术，将3T3成纤维细胞与原代的大鼠肝细胞共培养，18 d后，单独培养的原代大鼠肝细胞活力大大降低，丧失了分泌白蛋白和乙氧基-9-羟基异吩噁唑酮-邻-去乙基酶的能力，而共培养组中肝细胞活力保持不变，表现出良好的分泌功能，从而证实了拥有的3T3成纤维细胞的共同培养体系能够很好地保存肝细胞的活力和功能。于聪慧等［4］在研究肝细胞、胰岛细胞与储脂细胞共培养对肝细胞功能的影响时发现，这3种细胞共同培养能明显延长肝细胞的存活期。

2.4 调控细胞增殖

共培养体系中的辅助细胞可以调节目的细胞的生长状态。王东旭等［15］将大鼠髓间充质肝细胞与肝星状细胞共同培养一段时间后发现，大鼠髓间充质肝细胞能显著抑制肝星状细胞的生长，同时还阻止其从G0/G1期向S期转化，下调周期蛋白D1表达，上调P27的表达［15］。

2.5 促进早期胚胎的发育

共培养体系中的辅助细胞可以提高目的细胞的发育。胚胎共培养是指在培养基内加入某一种辅助细胞，如输卵管上皮细胞、子宫内膜细胞和卵丘细胞等与胚胎一起培养，从而更好地满足胚胎在不同细胞期对物质的需求。采用共培养的方式培养胚胎，建立更类似于体内环境的培养体系，使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，使胚胎的体外发育率得到大大的提高，从而避免早期胚胎的发育阻滞。有研究显示［16－18］，用人体子宫内膜细胞与体外受精-胚胎移植胚胎共培养，与在传统培养液中单独培养相比，胚胎细胞数显著增加，胞质碎片率明显下降，培养至囊胚阶段的胚胎数增加，种植率和妊娠率得到了提高。

除此之外，共培养体系促进早期胚胎发育的另一原因是其可代谢降解胚胎发育过程中产生的铵、次黄嘌呤和氧自由基等有毒物质，Tan等［19］研究结果表明，共培养细胞能降低培养液中的次黄嘌呤浓度，消除其对胚胎发育的抑制作用。Joo等［20］通过小鼠的胚胎与人输卵管细胞共培养时发现，共培养组的氧自由基浓度比对照组明显降低。

2.6 提高代谢物产量

共培养体系中的辅助细胞可以提高目的细胞产生的代谢产物。长期以来，利用植物细胞分离多种次级代谢产物的方法因具有不受环境生态和气候条件的限制、增殖速度比单纯植物栽培快以及较容易调控次级代谢产物合成等优点而备受关注［21］，而近年来，由于细胞共培养技术的发展，通过使用不同物种材料进行共培养来提高植物，特别是药用植物细胞的培养效率及其次级代谢产物合成的能力成为了一种有广阔前途的新技术。王义等［22］研究了人参悬浮细胞和胡萝卜悬浮细胞的共培养，发现共培养提高了人参细胞合成人参皂苷的能力。方静等［8］发现，被马兜铃酸诱导活化的肾小管上皮细胞可能通过分泌“转化生长因子β1”与肾间质成纤维细胞相互影响，导致其合成细胞外基质增多，故提出这一机制很可能是慢性马兜铃酸肾病肾间质纤维化的重要致病途径之一。

3 前景与展望

由于细胞间相互的影响对一些如增殖和分化的细胞特征发挥着重要的调控作用，为了模拟组织之间的相互作用，从而建立了共培养体系，该体系是将多种细胞置于同一环境中，如内皮细胞和平滑肌细胞，肿瘤细胞和内皮细胞，肝细胞和纤维细胞以及角膜上皮细胞和角膜细胞，用以研究这些细胞之间复杂的相互反应［23－26］，所以该体系比单一细胞培养更能够准确地反映整体情况。目前细胞共培养体系主要用于药效方面的研究，而用于毒理学方面的研究却非常少。共培养体系缩短实验次数、减少药物使用量、辨别药物的优先毒性靶器官以及研究药物代谢产物的不良作用等优点，均符合目前国际上所提倡的“3R原则(减少，替代，优化)”，因而可成为未来毒理学研究发展的方向之一。

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