CIK细胞制备方法的研究进展

贺孟来

（湖南长沙医学院，湖南 长沙 410219）

随着肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重，应对肿瘤的治疗模式也发生着日新月异的变化，各种肿瘤治疗的新药物、新技术、新方法层出不穷，其中各种肿瘤的免疫细胞治疗非常活跃[1-3]，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。CIK（Cytokine-Induced Killer）是细胞因子诱导的杀伤细胞治疗方法的简称，是国内外继淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）和CD3McAb激活的杀伤细胞（CD3AK）之后又一个在国内临床广泛开展的肿瘤治疗方法。1991年，斯坦福大学的Schmidt-Wolf等[4]首次报道了该细胞。具体方法是将患者外周血单核细胞（PBMNC）进行分离后，在体外经γ干扰素、CD3单抗、白细胞介素1和白细胞介素2等细胞因子刺激后获得的一群异质细胞，具有增殖速度快、杀瘤活性高、非MHC限制、对正常骨髓造血影响轻微等优点[5]。

目前CIK细胞的制备过程基本相同，主要参照美国斯坦福大学骨髓移植中心建立的CIK细胞培养方法[6]。第0天加入一定量IFN-γ，置37℃、5% CO2培养箱中培养24h，第1天加入适当的IL-2、CD3单抗和IL-1继续培养，每天观察细胞生长并根据情况进行扩增。本文总结了一些培养过程中存在的差异，以期实验室工作人员从中选择、借鉴，取长补短，建立一套优良的CIK细胞制备体系，更好服务于肿瘤细胞治疗的健康发展。

1 CIK细胞的来源

目前的实验研究和临床应用主要以自体外周血来源的CIK细胞为主要效应细胞，也取得了一些较为明显的效果[7,8]。现在CIK细胞的来源主要有外周血、脐带血和骨髓。

1.1 自体细胞

采集患者自体外周血中的单个核细胞经体外扩增后回输，优点是可避免由于交叉感染引发的疾病，安全性得到极大提高。

1.2 脐血来源细胞

脐血来源广泛，输注脐血来源CIK细胞不易引严重移植物排斥反应，脐血中CIK前体细胞含量高，易扩增更多的CIK细胞[9]。王家祥等[10]比较不同来源CIK细胞体外扩增和杀伤活性时发现，脐血CIK细胞体外扩增快，杀伤活性强，对肿瘤细胞的作用优于外周血CIK细胞。

1.3 骨髓来源细胞

黄文荣等[11]研究发现骨髓来源的CIK细胞增殖能力比外周血来源的CIK细胞稍差，这可能与骨髓和外周血中免疫细胞的分化程度及细胞因子调节网络的不同有关。考虑肿瘤患者放、化疗后骨髓的抑制情况，一定程度上限制了骨髓来源CIK细胞的临床应用。

1.4 异体细胞

目前基础研究常用的CIK细胞主要来自异体正常供着，来源广泛，然而在临床应用中可能会增加意外感染的机会[12]。

2 培养基选择

目前用于CIK细胞培养的培养基包括完全培养基（含10%AB型人血清RPMI1640）和无血清培养基。多数研究表明，无血清培养基可代替含血清的完全培养基[13,14]。

2.1 完全培养基，因含有人AB型血清，虽经HBV、HCV及HIV的检测，但因“窗口期”的存在或仍有可能传播其他疾病，安全性不高，并且存在批次差异、不宜质控，质量不能保证。

2.2 无血清培养基，则可达到生物洁净要求，成分明确，质量稳定，便于质控，克服了人AB血清的缺点，能减少患者意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。

3 细胞因子差异

南京大学附属医院邹征云等[15]采用从50mL外周血中分离外周血单个核细胞后，分别应用A、B方法进行培养。A法应用γ-IFN、CD3mAb、IL-2和植物血球凝集素（PHA）行常规培养；B法在A法的基础上于培养的第2天，另外加入终浓度为10ng/mL IL-4，1000U/mL的GM-CSF。培养2周发现，B法可使CIK增殖倍数明显提高，最高可达840倍。结论是在CIK培养的第2天，增加细胞因子IL-4和GM-CSF可使CIK得率更高，细胞总数＞5×109，从而使得一次性采血50mL制备的CIK足以满足临床回输治疗需要。

北京军区总医院郭智等[16]治疗复发或难治性淋巴瘤患者采用的CIK细胞制备方法加入细胞因子的顺序有所不同：培养第1天加入抗人CD3单抗100ng/mL、人重组IL-1α 100U/mL、人重组IFN-γ1000U/mL，第2天加入人重组IL-2 300U/mL，每3天更换培养液并添加人重组IL-2和人重组IFN-γ以维持其浓度，培养12～14d收获CIK细胞。

4 培养袋法

常规CIK细胞培养是采用大量的培养瓶，工作量大，且容易污染。北京大学第一医院石永进等[17]采用1000mL大容量培养袋进行自体CIK细胞大容量培养方法。培养容器采用1000mL大容量培养袋，用一次性注射器进行细胞的定量加样、取样，换液时将培养袋在大容量离心机中离心1000rpm 10min，再用分浆夹挤出上清，新配好的培养液经输液管插入培养袋进液管后输入培养袋，密封后放入37℃恒温培养。结果表明大容量培养法使自体CIK细胞扩增总量达1.6×1010以上，回输CIK细胞使患者PBMNC的杀伤活性明显增加，未出现不良反应。此方法仅使用3～5个1000mL培养袋即可完成常规方法同样的工作量，操作更简便，全封闭的培养操作方式使污染概率大大降低，回输更安全。

CIK细胞过继免疫疗法作为一种新的治疗手段，实验室与临床统一的操作规程和标准尚未制定，需要探讨的问题还有很多。以上方法值得我们借鉴和完善，今后我们将致力于如何用最经济的方法获得足量高效的免疫活性细胞，以便在临床上更推广应用。

[1]Hoffman DM,Gitlitz BJ,Belldegrun A,et al.Adoptive cellular therapy[J].Seminars in Oncology,2000,27(2): 221- 233.

[2]Sa YL,Hua YK,Yan XM,et al.The preliminary clinical application of Adoptive immunotherapy with auto- cytokine induced killer cells in the patients with malignant solid tumor[J].The Pratical Journal of Cancer,2006,21(1):11-14.

[3]Y Sun,J Chen,P Cai,et al.Therapy of relapsed or refractory non-Hodgkin's lymphoma by antigen specific dendric cells-activated lymphocytes[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2010,18(1):219-23.

[4]Schmidt-Wolf IG,Negrin RS,Kiem HP,et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine induced killercells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991,174(1):139-149.

[5]Schmidt-Wolf IG,Grimm B,Brandt K,et al.Propagation of large numbe0rs of cells of a human mixed-lineage T-lymphoid/myeloid[J].British Journal of Haematology,1995,90(3):512-517.

[6]Lu PH,Negrin RS.A novel population of expanded human CD3 CD56 cells derived from T cells with potent in vivo antitumoractivity in mice with severe combined immunodeficiency[J].J Immunol,1994,153(4):1687-1696.

[7]Leemhuis T,Wells S,Schefold C,et a1.A phase I trial of autologous cytokine-induced killer cells for the treatment of reapsed Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma[J].Biol Blood Marrow Transp lant,2005,11(3):181-187.

[8]Cai LL,Yang B,Lu XC,et al.Application of immune function test to evaluate effect of cytokine-induced autologous killer cell infusion for ederly patients with hematological malignancies. [J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2010,18(5):1250-1255.

[9]李鹏鑫,李贵新.细胞因子诱导的杀伤细胞制备的研究进展[J].医学综述,2009,15(20):3071-3073.

[10]王家祥,郑树,刘秋亮.不同来源CIK细胞的体外扩增和杀伤活性的比较[J].第四军医大学学报,2005,26(7):616-618.

[11]黄文荣,张伯龙,靳海杰,等.细胞因子联合激活人骨髓和外周血免疫细胞的比较研究[J].中国实验血液学杂志,2002,10(3):222-225.

[12]Sangiolo D,Martinuzzi E,TodorovicM,et al.Alloreactivity and anti-tumor activity segregate within two distinct subsets of cytokine-induced killer(CIK) cells: implications for their infusion acrossmajor HLA barriers[J].Int Immunol,2008,20(7):841-848.

[13]Kambe N,Kambe M,Chang HW,et al.An improved proved procedure for the development of human mast cells from dispersed fetal liver cells in serum-free cuture medium[J].J Immunol Methods,2000,240(1-2):101-110.

[14]蒋永新,李高峰,王熙才,等.无血清培养基与完全培养基体外诱导扩增CIK细胞分泌细胞因子水平的比较[J].肿瘤防治研究,2006,33(11):784-787.

[15]邹征云,刘宝瑞,钱晓萍,等.从50mL外周血中高效扩增CIK方法的探讨[J].肿瘤防治杂志,2005,12(7):515-518.

[16]郭智,陈丰,谭晓华,等.细胞因子诱导的杀伤细胞体外培养技术的评价[J].神经损伤与功能重建,2009,4(2):110-113.

[17]Shi Y,Yu J,Cen X,et al.Large-capacity expanded cytoline-induced killer cells and its cytotoxic activity[J].Sheng Wu Yi Xue Za Zhi,2001,18(1):94-96.