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MLVA技术在沙门菌分型和分子流行病学研究中的应用

2011-02-11陈春霞综述审校

中国人兽共患病学报 2011年10期
关键词:沙门噬菌体血清型

陈春霞(综述),阚 飙(审校)

MLVA技术在沙门菌分型和分子流行病学研究中的应用

陈春霞(综述),阚 飙(审校)

沙门菌属是属于肠杆菌科的一类生化特性、抗原结构和DNA同源性等相关的革兰阴性菌,广泛存在于自然界,能引起多种动物感染。人源感染主要是通过污染食物从而引起的食物中毒。目前沙门菌感染是全球范围内最常见的食源性疾病之一[1]。全球每年估计发生13亿因沙门菌导致的急性胃肠炎病例,其中300万患者死亡[2]。在美国,估计沙门菌所致感染占所有由食源性致病菌引起感染的26%[3],每年沙门菌感染的有140万病例,引起17 000人住院并且将近600人死亡[4],导致的经济损失每年约为24亿美元[5]。我国沙门菌感染的情况也很严重,多年来一直居细菌性食物中毒的首位(占64%),2005年共发生沙门菌食物中毒24起,1 358人中毒,其中死亡2人[6]。

对菌株进行分离和分型是用于疾病常规监测、流行病学研究、暴发调查和溯源追踪的一种重要的工具,而不是仅仅为了感染性疾病的病原学诊断。多位点的可变串联重复(VNTR)分析是近年发展起来的以PCR技术为基础的分子分型方法,由于其操作简单、快速、可重复性好、分辨率高并且不同的实验室之间结果易于比较等优点,已应用于多种细菌的分子分型[7]。国际病原菌分子分型实验室监测网络(PulseNet)已将MLVA列为第二代分子分型方法[8],其中沙门菌中的鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌在PulseNet中已经分别确立了标准化方案。本文就MLVA技术及其在沙门菌流行病学研究和分析中的应用作综述。

1 用于MLVA分析的VNTR位点的筛选

MLVA中VNTR(可变数目序列重复),由串联重复的单一DNA原件组成[9]。许多细菌基因组DNA都含有重复序列,这些重复序列是以多拷贝形式存在在全基因组上。同一种属的不同的单个细菌常常含有相同的重复序列但是串联重复的数目不同,而串联重复序列的两侧侧翼区域在不同的单个菌株中显示序列同源性,因此在重复序列的侧翼区域设计引物进行PCR扩增,根据PCR产物的长度,可以推导每一个位点的重复单位数目,从而确定串联重复单位的拷贝数的变异情况,可以反映不同菌株的遗传多样性。

细菌全基因组序列测序已经大大推进了识别用于菌株分型的VNTR的方式,从而为重复DNA的评价和对流行病学调查的应用开辟了道路。通过应用能够快速扫描全基因组的软件,VNTR位点能够迅速的被定位,PCR引物可以根据侧翼序列进行设计。目前用于筛选VNTR位点的常用软件包括TRF(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)[10]和TRD(http://minisatellites.u-psud.fr)[11]。对于这两个软件产生的串联重复位点都可以用免费在线软件进行引物设计(www.biotools.umassmed.edu/biopass/primer3_www.cgi)。需要强调的是这两个软件筛选出来的某种细菌基因组的位点,在不同菌株中大多数可能有非常低的或者没有多态性,因此每一个位点在用于基因分型之前,应当选择一组遗传学无关的菌株对位点重复数的多态性进行评价[11]。

2 MLVA在沙门菌菌株分型和分子流行病学中的应用

2.1 菌株分子分型 在沙门菌感染流行中,对菌株进行准确的分子分型,对发现暴发和寻找感染源头以及控制传播是很重要的。Bjørn-Arne Lindstedt等[12]在2003年筛选了8个VNTR位点对78株分离自1993-2002年的鼠伤寒沙门菌尤其是其中的噬菌体DT104型菌株进行DNA指纹图谱研究,将78株菌分成了54种VNTR带型,其中37株噬菌体DT104型菌株发现有28种不同的VNTR带型。这种VNTR方法与XbaⅠ-PFGE、AFLP、整合子基因图谱和四种基因的PCR方法进行了比较,结果显示了VNTR方法具有分辨率高、简单快速、重复性好、结果易于解释和可以完全自动化分析等多种优点,随后MLVA方法用于多种沙门菌血清型的基因分型的报道也越来越多[13],并且展示了非常好的分型结果。Liu等[14]应用3个VNTR位点用多重PCR方法对来自新加波、印度尼西亚、印度、孟加拉、马来西亚和尼泊尔等几个亚洲国家的伤寒沙门菌进行分子分型,59株菌被分成了49种不同的型别,并且同一个国家内和不同国家间的菌株也都显示高水平的VNTR图谱异质性,提示了这种基于3个VNTR位点的方法具有高度的分辨率,能够为伤寒沙门菌的流行病学分析提供了非常有用的信息。Malorny等[15]报道了一种新的具有高分辨率的MLVA方法用于肠炎沙门菌的分型,应用9个位点的MLVA方法对240株分离自人、动物、食品和环境的包含23中噬菌体型的肠炎沙门菌进行分析,共分成79种不同的MLVA型,MLVA的Simpson多样性指数在研究的菌株样本中是0.919。研究中62株肠炎沙门菌噬菌体PT4型菌株分成了24种MLVA型,81株肠炎沙门菌噬菌体PT8型菌株分成21种型,因而这9个位点的MLVA方法是非常有用的用于区分肠炎沙门菌尤其是单一的噬菌体型菌株。Davis等[16]用6个位点的 MLVA方法将132株纽波特沙门菌菌株分成40种不同的型别,每一种型别的菌株数目从1-26不等,Simpson多样性指数是0.91,略高于PFGE。MLVA的高分辨率和能够更快的获得结果使得其成为纽波特沙门菌区域监测和暴发调查的强大的补充或替代的技术。Tien等[17]比较了PFGE和MLVA两种分型技术用于甲型副伤寒沙门菌的分子分型,XbaⅠ-PFGE和BlnⅠ-PFGE两种酶的组合将55株菌分离自南亚和东南亚的至少6个国家的跨越10年时间的甲型副伤寒菌株分成14种型,分辨指数(DI)是0.741,同样的菌株,基于6个VNTR位点的MLVA方法能将其分成23种型别,分辨指数是0.937,显著高于PFGE,因此认为MLVA能获得明确的数据,是高通量的并且具有较高的分辨率,能够成为一种选择的分型方法补充PFGE用于甲型副伤寒沙门菌的流行病学调查。Bergamini等[18]发展了6个位点的 MLVA方案用于分析55株鸡沙门菌,并且将其结果与3种酶切(XbaⅠ、SpeⅠ和XhoⅠ)的PFGE进行比较,MLVA将55株菌分成21种型,3种酶的PFGE的组合将其分成18种型,显示MLVA的分辨率同等于3种酶的PFGE组合,但是MLVA方法易于操作,结果解释更加直观明了。这些研究都充分展示了MLVA方法在沙门菌的分型和监测方面具有广阔的应用前景,为沙门菌的监测及防治提供了最有利的手段。

2.2 流行病学调查 传染病的流行病学调查,在某种程度上,依赖于实验室特征描述或分型数据。菌株分型通过从散发病例中区分暴发相关的病例,证实涉嫌的传染源,从而推进了普通来源暴发的鉴定并且增强了流行病学调查。目前MLVA方法在沙门菌的流行病学调查和溯源的追踪方面已经显示巨大的前景。Ross等[19]应用 MLVA和噬菌体分型方法作为辅助工具用于鼠伤寒沙门菌流行病学调查,结果说明了MLVA和噬菌体分型能够为沙门菌暴发的流行病学调查提供不同的但是互补的信息。Torpdahl等[20]用 MLVA方法鉴定了一起由鼠伤寒沙门菌引起的区域暴发并且追踪了其传染源,所有的暴发菌株都有相同的噬菌体型、MLVA型和PFGE型,但是仅仅MLVA方法能将对照菌株和暴发菌株分开,进一步的研究发现一株来自猪群的菌株及其位于暴发相同地理区域的相应的屠宰场与人源菌株有相同的PFGE和MLVA型别,结合流行病学资料证实了这次区域暴发是由猪群引起的鼠伤寒沙门菌噬菌体DT12型的区域感染。其他的研究也证实了MLVA在沙门菌尤其是相同沙门菌血清型的不同噬菌体型的菌株引起的多地暴发调查和溯源追踪方面是一种非常可靠的工具[21-25]。

2.3 种系发生研究 MLVA除了用于沙门菌的分子流行病学研究外,还可以了解菌株间的遗传进化关系。细菌的变异能够根据在特异的染色体位点上的等位基因的变异所解释,这是MLVA为群体遗传分析和种系发生学推论提供了理论依据。Octavia和Lan[26]用9个位点的 MLVA方法分析伤寒沙门菌,73株分离自全球的菌株被分成70种不同的型别,种系发生分析显示这些MLVA型别能被分成7个簇(cluster)。这些簇能被某些特定VNTR等位基因所支持,但是在每一个簇中并不是唯一包含这种特异的VNTR等位基因,因此认为VNTR的数据过于分散,不能推论确凿的亲缘关系,但是种系发生分析可以使我们确定来自同一地区的菌株是否有流行病学联系。但Chiou等[27]认为基于较多VNTR位点组合的MLVA方法在建立菌株的种系发生关系时可能是一种非常有用的工具。他们确立了基于16个位点的MLVA方法描述鼠伤寒沙门菌的分型和种系发生研究,其中4个最可变的VNTR位点将183株不相关的鼠伤寒沙门菌和203株亲缘关系相近的鼠伤寒沙门菌分别分成157和108种型,显示了比PFGE更高的分辨率,尤其在亲缘关系相近的菌株中。而这16个位点能将203株亲缘关系相近的鼠伤寒沙门菌分成了118中不同的型别,种系发生树分析呈现了4种不同簇,并且这4个簇分别与4种不同的噬菌体型相匹配,呈现了非常好的种系发生关系。因此基于一小组高度可变的位点的MLVA有极高的分辨率区分亲缘关系相近的菌株,而基于一大组VNTR位点的MLVA方法更易于清楚的将菌株分成不同进化组。在发展一种新的MLVA方案时,应尽可能的找出基因组上所有的可能的VNTR位点。

3 展 望

VNTR位点的选择对确保MLVA分型最优操作参数具有重要意义,如太不稳定的位点可能被包含进去,这样就不能完全反应菌株基因型的真正的分布或者可能隐藏了一次暴发。因此MLVA分型方法中的VNTR位点组合在应用于标准化的分型方案前,需要进行大量菌株的分析验证,包括对菌株进行实验室内的长期传代,然后对子代菌株再进行分型分析,以确保每一个位点的稳定性和可重复性。MLVA方法另外一个缺点是目前同一种沙门菌血清型的测序株太少,往往所得到的VNTR数据只能从一株菌中或者与其他沙门菌血清型的测序株比较得到的。这种从一株菌中获得的VNTR数据可能导致某些沙门菌血清型的跨越重复区域设计引物成为问题。因为这些侧翼区域可能也是有多态性的[14]。而不同沙门菌血清型具有不同的遗传学背景,一组特定的MLVA引物组合对某种沙门菌血清型有高度的分辨率,但是对其他的沙门菌血清型可能没有分辨能力,因此筛选每一种沙门菌血清型的合适的MLVA位点不能依赖于其他血清型公布的基因组序列。随着基因组测序技术的进步,更多沙门菌血清型基因组被测序,MLVA必将在沙门菌的分子流行病学研究中得以广泛的应用,并且有可能替代PFGE方法作为沙门菌的主要分型方法[28-30]。

[1]Swaminathan B,Gerner-Smidt P,Barrett T.Focus onSalmonella[J].Foodborne Pathog Dis,2006,3(2):154-156.

[2]Pang T,Bhutta ZA,Finlay BB,et al.Typhoid fever and other salmonellosis:a continuing challenge[J].Trends Microbiol,1995,3(7):253-255.

[3]Mead PS,Slutsker L,Dietz V,et al.Food-related illness and death in the United States[J].Emerg Infect Dis,1999,5(5):607-625.

[4]Voetsch AC,Van Gilder TJ,Angulo FJ,et al.FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidalSalmonellainfections in the United States[J].Clin Infect Dis,2004,38(Suppl 3):127-134.

[5]Callaway TR,Edrington TS,Anderson RC,et al.Gastrointestinal microbial ecology and the safety of our food supply as related toSalmonella[J].J Anim Sci,2008,86(Suppl 14):163-172.

[6]朱超,徐学斌.沙门菌属血清型诊断[M].上海:同济大学出版社。2009:1.

[7]Lindstedt BA.Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria[J].Electrophoresis,2005,26(13):2567-2582.

[8]Hyytia-Trees E,Smole SC,Fields PA,et al.Second generation subtyping:aproposed PulseNet protocol for multiple-locus variable-number tandem repeat analysis of Shiga toxin-producingEscherichiacoliO157 (STEC O157)[J].Foodborne Pathog Dis,2006,3(1):118-131.

[9]van Belkum A.The role of short sequence repeats in epidemiologic typing[J].Curr Opin Microbiol,1999,2(3):306-311.

[10]Benson G.Tandem repeats finder:aprogram to analyze DNA sequences[J].Nucleic Acids Res,1999,27(2):573-580.

[11]Denoeud F,Vergnaud G.Identification of polymorphic tandem repeats by direct comparison of genome sequence from different bacterial strains:a web-based resource[J].BMC Bioinformatics,2004,5:4.

[12]Lindstedt BA,Heir E,Gjernes E,et al.DNA fingerprinting ofSalmonellaentericasubsp.entericaserovar typhimurium with emphasis on phage type DT104based on variable number of tandem repeat loci[J].J Clin Microbiol,2003,41(4):1469-1479.

[13]Kruy SL,van Cuyck H,Koeck JL.Multilocus variable number tandem repeat analysis forSalmonellaenterica subspecies[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2011,30(4):465-473.

[14]Liu Y,Lee MA,Ooi EE,et al.Molecular typing ofSalmonella entericaserovar typhi isolates from various countries in Asia by a multiplex PCR assay on variable-number tandem repeats[J].J Clin Microbiol,2003,41(9):4388-4394.

[15]Malorny B,Junker E,Helmuth R.Multi-locus variable-number tandem repeat analysis for outbreak studies ofSalmonella entericaserotype Enteritidis[J].BMC Microbiol,2008,8:84.

[16]Davis MA,Baker KN,Call DR,et al.Multilocus variablenumber tandem-repeat method for typingSalmonellaentericaserovar Newport[J].J Clin Microbiol,2009,47(6):1934-1938.

[17]Tien YY,Wang YW,Tung SK,et al.Comparison of multilocus variable-number tandem repeat analysis and pulsed-field gel electrophoresis in molecular subtyping ofSalmonellaentericaserovars Paratyphi A[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2011,69(1):1-6.

[18]Bergamini F,Iori A,Massi P,et al.Multilocus variable-number of tandem-repeats analysis ofSalmonellaentericaserotype Gallinarum and comparison with pulsed-field gel electrophoresis genotyping[J].Vet Microbiol,2011,149(3-4):430-436.

[19]Ross IL,Davos DE,Mwanri L,et al.MLVA and Phage Typing as Complementary Tools in the Epidemiological Investigation ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium Clusters[J].Curr Microbiol,2011,62(3):1034-1038.

[20]Torpdahl M,Sorensen G,Ethelberg S,et al.A regional outbreak ofS.typhimuriumin Denmark and identification of the source using MLVA typing[J].Euro Surveill,2006,11(5):134-136.

[21]Much P,Pichler J,Kasper S,et al.A foodborne outbreak ofSalmonellaEnteritidis phage type 6in Austria,2008[J].Wien Klin Wochenschr,2009,121(3-4):132-136.

[22]Heck M.Multilocus variable number of tandem repeats analysis(MLVA)-a reliable tool for rapid investigation ofSalmonellatyphimurium outbreaks[J].Euro Surveill,2009,14(15):1.

[23]Munnoch SA,Ward K,Sheridan S,et al.A multi-state outbreak ofSalmonellaSaintpaul in Australia associated with cantaloupe consumption[J].Epidemiol Infect,2009,137(3):367-374.

[24]Nygard K,Lindstedt BA,Wahl W,et al.Outbreak ofSalmonellaTyphimurium infection traced to imported cured sausage using MLVA-subtyping [J]. Euro Surveill, 2007, 12(3):70315.

[25]Slinko VG,McCall BJ,Stafford RJ,et al.Outbreaks ofSalmonellaTyphimurium phage type 197of multiple genotypes linked to an egg producer[J].Commun Dis Intell,2009,33(4):419-425.

[26]Octavia S,Lan R.Multiple-locus variable-number tandem-re-peat analysis ofSalmonellaentericaserovar Typhi[J].J Clin Microbiol,2009,47(8):2369-2376.

[27]Chiou CS,Hung CS,Torpdahl M,et al.Development and evaluation of multilocus variable number tandem repeat analysis for fine typing and phylogenetic analysis ofSalmonellaentericaserovar Typhimurium[J].Int J Food Microbiol,2010,142(1-2):67-73.

[28]Ramisse V,Houssu P,Hernandez E,et al.Variable number of tandem repeats inSalmonellaentericasubsp.entericafor typing purposes[J].J Clin Microbiol,2004,42(12):5722-5730.

[29]Gilbert GL.Using MLVA to type strains ofSalmonellaTyphimurium in New South Wales[J].N S W Public Health Bull,2008,19(1-2):29-31.

[30]Boxrud D,Pederson-Gulrud K,Wotton J,et al.Comparison of multiple-locus variable-number tandem repeat analysis,pulsedfield gel electrophoresis,and phage typing for subtype analysis ofSalmonellaentericaserotype Enteritidis[J].J Clin Microbiol,2007,45(2):536-543.

R378.2

A

1002-2694(2011)10-0929-04

阚飙,Email:kanbiao@icdc.cn

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室/国家传染病预防控制重点实验室,北京 102206

2011-03-14;

2011-06-17

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