湖北茯苓菌种生产技术规程△

李苓，王克勤，边银丙，苏玮，王兰英

（1.北京同仁堂湖北中药材有限公司，湖北 武汉 430071；2.湖北省中医药研究院，湖北 武汉 430074；3.华中农业大学，湖北 武汉 430074）

湖北茯苓菌种生产技术规程△

李苓1，王克勤2*，边银丙3，苏玮2，王兰英1

（1.北京同仁堂湖北中药材有限公司，湖北 武汉 430071；2.湖北省中医药研究院，湖北 武汉 430074；3.华中农业大学，湖北 武汉 430074）

按照我国 《中药材生产质量管理规范（GAP）》的综合技术要求，通过对湖北茯苓菌种培育场地环境，菌种制备，质量标准与检验规程等规范化研究，制订了湖北茯苓菌种生产技术规程，以指导湖北茯苓产区茯苓菌种的规范化生产。

茯苓；菌种；规范化

茯苓是我国传统常用中药材及药食兼用资源，其物种为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf[1]。野生茯苓在我国分布较广，但零星分散，难以采挖，茯苓药材多由人工栽培提供。我国是世界上唯一进行茯苓栽培的国家[2]，有着悠久的栽培历史，长期由产区农民使用松树段木或树蔸作培养料，选用新鲜菌核作种源，20世纪70年代以来，改进为人工分离、培育的 “纯菌丝菌种”作种源，进行扩大培育[3]。 “九五”期间，我们针对茯苓栽培中普遍存在的菌种来源混杂，生产操作随意，质量不稳等弊端，进行了 “茯苓药材规范化种植研究”[4]，期间按照我国 《中药材生产质量管理规范（GAP）》的综合技术要求，制订了 “茯苓菌种生产技术规程”，现报道如下。

1 内容与适用范围

本规程规定了茯苓菌种规范化生产技术的术语和定义，母种分离、培养，原种扩制，栽培种生产，菌种质量标准，菌种质量检验规程，菌种的包装、标识、储存及运输。

本规程适用于湖北及我国茯苓产区茯苓菌种的规范化生产。

2 引用标准

GB3095-1996大气环境质量二级标准

GB5749-2006生活饮用水卫生标准

NY/T528-2002食用菌菌种生产技术规程

《中药材生产质量管理规范（试行）》国家药品监督管理局局令第32号

《湖北省食用菌菌种管理办法》湖北省人民政府令第330号

3 定义

3.1 菌种（pure culture）

经人工培养并可供进一步繁殖或栽培使用的茯苓菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料，包括母种、原种、栽培种。

3.2 种苓（mother sclerotium）

经精心培育、选择，用于分离茯苓母种的优质鲜茯苓菌核。

3.3 菌龄（cell ages）

菌种菌丝体的生长时间，即菌种自接种至使用之间的间隔时间。

4 母种分离、培养

4.1 母种培育厂的环境及设施要求

一般设置在大专院校或科研单位，应具有接种室、仪器室、配料室、实验室。必须配备恒温培养箱、干燥箱、冰箱、显微镜、天平及接种设备，试管、培养皿、三角瓶等玻璃仪器，消毒药品，化学试剂等。

从事母种分离、培育的人员必须具备药学、生物或相关学科大学学历、副高级药学技术职称及执业药师资格，并具有独立工作能力和丰富的操作经验。

4.2 种苓的选择

在传统产区，经提前精心培育而成的优质鲜茯苓菌核；个体较大，近球形，外皮较薄，色黄棕或淡棕，有明显的白色或淡棕色裂纹，重量＞2.5 kg；生长旺盛，切开或掰开后，内部苓肉色白，茯苓气味浓郁，有乳白色汁液或淡青色浆汁渗出；外皮完整，无虫咬损伤，无腐烂异味。

种苓选定后要及时进行分离使用，若需暂短储存或运往他地使用，必须埋于湿沙中储存，以防干燥。

4.3 母种培养基的制备

4.3.1 配方 马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL。

4.3.2 配制 将马铃薯去皮，洗净，切片，加水1 000 mL，煮沸30 min，过滤，滤液中加入琼脂，煮至全部溶化，再加入葡萄糖，搅拌溶化，补足水分至1 000 mL，分装于试管中，塞上棉塞。

4.3.3 灭菌 将配制的母种培养基置高压灭菌锅内，用1.05 kg·cm－2压力（温121℃）灭菌30 min，趁热摆放斜面，冷却后备用。

4.4 组织分离

4.4.1 分离前准备 按无菌操作法对无菌室或无菌箱内的空气、环境、操作台面、用具及移入的培养基试管等进行表面消毒灭菌，操作人员按无菌操作着装、手部消毒。

4.4.2 种苓表面消毒 将选好的种苓用清水冲至无泥沙，待表面稍干后，移入无菌室净化工作台上。用0.2%升汞或70%乙醇冲洗，进行表面消毒，再用无菌水冲洗数遍，除去表面药液。打开紫外线灯照射5～10 min。

4.4.3 种苓切剖 待种苓表面稍干，用灭菌刀从种苓的中央切一浅口，掰开。

4.5 接种

用灭菌的解剖刀或接菌铲在近茯苓皮内侧2～3 cm处，挑取0.1 cm厚、0.5 cm见方的白色苓肉，接于试管斜面培养基上。

用同样方法依次挑取苓肉进行分离、接种一批试管。将分离、接种后的试管，贴上标签，其内容应符合 《湖北省食用菌菌种管理办法》规定，如编号、种苓来源、接种时间等。

4.6 培养与剔杂

将试管置于22～25℃的恒温培养箱中培养5～7 d。培养2 d，可见接种块周围长出白色绒毛状的茯苓菌丝。随着培养时间的延长，可见茯苓菌丝在培养基上不断延伸，5～7 d，茯苓菌丝即可长满培养基表面。培养过程中经常观察菌丝生长情况，凡菌丝长速慢、稀疏、不匀、发黑、污染者，须及时剔出。母种转管次数应控制在2～3次。

5 原种扩制

5.1 原种厂的环境及设施要求

可选建在产区，但必须远离交通干道，通水、通电、通路，无粉尘污染，大气、水质等环境质量，必须符合国家相关标准，厂房周围应有绿化树木或草皮，生产区周围无猪圈、牛栏、厕所等污染源。厂内环境必须整洁、干净，并定期打扫、清理，保持墙壁及地面清洁卫生，做到无尘垢、无污秽。

原种厂须经县级农业部门审查批准，领取菌种生产许可证。厂内分设洗涤室、配料室、灭菌室（区）、接种室（具缓冲间）、培养室、贮存室等，必须配备接种箱、高压灭菌锅或常压灭菌灶（自制）、恒温箱、培养室木架、天平、磅秤及接种设备，玻璃仪器，消毒药品，化学试剂等。

从事原种扩制、培育的人员必须具备高中以上（含高中）学历、农业技术员职称，掌握微生物基础知识，具有独立工作能力及熟练的操作技能。讲究个人卫生，操作中必须使用专用的工作服、帽。严格操作，认真填写原始记录。

5.2 原种培养基的制备

5.2.1 配方 小麦粒90%、松木屑10%、营养液[1%蔗糖、0.5%NH4NO3或（NH4）2SO4]。

5.2.2 配制 除去麦粒瘪粒、杂质，洗净，置40℃左右的营养液中浸泡10 h，取出，沥干，与5%的松木屑混匀，装于500 mL广口瓶或折角呈方形底的聚丙烯塑料袋（Φ12 cm，高25 cm，厚4丝）中，边装边振摇，并用扁形铁钩或细木棒稍压实，使之均匀装至瓶（或袋）肩处。将另5%松木屑用营养液润湿，覆盖于培养基表面，厚约0.5 cm。揩净瓶（或袋）内、外壁沾附物，塞紧棉塞，扎口。

5.2.3 灭菌 将配制的原种培养基置高压蒸气灭菌锅内，用0.137 3 MPa压力（温度126℃）灭菌2 h，或用流通蒸气（100℃）灭菌8～10 h，冷却后备用。

5.3 接种

在无菌室内，用无菌操作法，挑取长宽各1.5 cm左右的优质母种块（连同培养基），移植接种于母种培养基上端中央，随即盖塞或扎口。

在接种后的原种瓶（袋）上贴上标签，其内容应符合 《湖北省食用菌菌种管理办法》规定，如编号、母苓来源、接种时间等。

5.4 培养与剔杂

将接种后的原种瓶（袋）置于25～30℃培养室中培养。当茯苓菌丝生长至瓶（袋）内2/3处时，移入10～25℃的常温培养室内继续培养。接种后的母种块，在原种培养基内培养1～2 d，可见茯苓菌丝恢复生长，并逐渐由母种块向外延伸。培养过程中须经常检查菌丝生长情况，凡表现异常，特别是长速慢、菌丝稀疏、不匀、发黑、污染者须及时剔出，深埋。

5.5 清场

每一批次的原种生产完成后，均应进行清场，包括清除生产中的废弃物，作好环境清洁，将物品定位放置，并做好清场记录。

6 栽培种生产

6.1 栽培菌种厂的环境及设施要求

茯苓栽培菌种厂可选建在产区，厂周及厂内环境要求等与原种厂相同。

栽培菌种厂须在乡镇（或县）备案。厂内分设洗涤室、配料室、灭菌室（区）、接种室（或接种箱）、冷却室、培养室、成品贮存室、原料贮藏室、工作室等。菌种厂要求安装防虫、防鼠设备，并配备常压灭菌灶（自制）、培养室木架、天平、磅秤及接种设备，必要玻璃仪器，消毒药品，化学试剂等。

从事栽培菌种生产、培育的人员必须具备初中以上（含初中）学历，经专业技术培训合格，熟悉微生物基础知识，具有独立工作能力及操作技能。讲究个人卫生，操作中必须使用专用的工作服、帽。严格操作，认真填写原始记录。

6.2 栽培种培养基的制备

6.2.1 配方 松木屑78%、米糠（或麦麸）20%、蔗糖1%、熟石膏1%、水料比1∶1.0～1.2。松木屑要求新鲜、干燥，无霉变，使用前应经日晒或室内堆放干燥处理。

6.2.2 配制 首先将蔗糖溶于水，将米糠（或麦麸）与熟石膏混匀，再加入松木屑，拌匀，然后加入蔗糖水翻拌均匀，使培养基含水量65%～70%（即紧握培养基料使指尖稍见渗水为度）。放置30 min，待水分均匀渗入料中进行装袋；将折角呈方形底的聚丙烯塑料菌种袋（Φ12 cm，高25 cm，厚4丝）撑开，装料，每袋400 g左右，压实，擦净袋口内外壁沾附物，扎口。

6.2.3 灭菌 将上述料袋置高压灭菌锅内，用0.137 3 MPa压力（温度126℃）灭菌2 h，或置常压灭菌灶内，用流通蒸气（100℃）灭菌8～10 h，冷却后备用。

6.3 接种

在无菌室内，用无菌操作法，将原种瓶（袋）打开，除去原种表面的菌膜及表面培养物。用接种枪或接种匙取5 g左右略加捣碎的原种块，移于栽培种培养基上，封口。

在接种后的菌袋上贴上（印有）标签，其内容符合 《湖北省食用菌菌种管理办法》规定，如编号、原苓来源、接种时间等。

6.4 培养与剔杂

高温培养：将接种后的菌种袋连同周转箱一起置于高温培养室内，在25～30℃温度下培养。

常温培养：待菌丝生长延伸至培养料2～3 cm处，移入10～25℃的常温培养室内继续培养，20～30 d，茯苓菌丝可长满菌袋。

培养过程中，经常检查培养室温、湿度变化及菌丝生长情况，发现菌丝长速明显缓慢，菌丝稀疏、不均、地图斑、发黑、杂菌污染，及时剔出，深埋。菌丝满料后，逐一检查菌种质量，合格品装入专用包装袋内，按批号归类就地储存。

6.5 清场

每一批次栽培种生产完成后，均应进行清场，包括清除生产中的废弃物，作好环境的清洁，将物品归位，并做好清场记录。

7 菌种质量标准

7.1 母种质量标准

菌龄＜30 d；菌丝色白、均匀、致密、粗壮，茯苓特异香气浓郁；菌丝体表面可见晶莹的露滴状分泌物；菌种试管完整无损，棉塞严密，无杂菌污染。

7.2 原种质量标准

菌龄20～45 d；菌丝生长旺盛，洁白、均匀、致密，爬壁现象明显，有根状菌索者佳；菌丝体尖端可见乳白色露滴状分泌物，茯苓特异香气浓郁；菌种瓶（或袋）完整无损，无杂菌污染。

7.3 栽培种质量标准

菌龄30～60 d；菌丝洁白致密，生长均匀，布满菌袋内；菌丝体尖端可见晶莹露滴状分泌物，茯苓特异香气浓郁；菌袋完整无破损，菌丝充满菌种袋（满料），手握菌种袋，感觉坚实，无松散，无软化。菌丝无发黄、发黑，地图斑，软化，无子实体出现，无杂菌污染。

8 菌种质量检验规程

8.1 母种质量检验规程

按照茯苓母种质量标准，在自然光下采取目测方法，每隔2 d于培养过程中观察各试管菌种萌发情况、生长速度、菌丝形态；凡表现异常，特别是长速慢、菌丝稀疏、不匀、发黑、污染者，应及时淘汰剔出；菌丝满管后，按上述质量标准逐支检查，合格者置冰箱4℃保存。

8.2 原种质量检验规程

按照茯苓原种质量标准，在自然光下采取目测方法，于培养过程中经常观察各菌种瓶内菌种萌发、生长情况；凡发现菌丝长速明显缓慢，菌丝稀疏、不均、地图斑、发黑、污染者，应及时剔出；菌丝满瓶后，按上述质量标准逐瓶检查，合格者方可转于下一道工序，作为茯苓栽培种生产的种源。

8.3 栽培种质量检验规程

按照茯苓栽培种质量标准，在自然光下采取目测法，于菌种培养过程中经常观察各菌种袋内菌种生长情况；发现菌丝体发黄、发黑、不均、地图斑、污染者，应及时剔出；逐一检查各菌种袋，应符合上述质量标准，且菌丝长满菌种袋（满料），菌丝无倒伏现象；手握菌种袋，感觉坚实，无松散，无软化；检验合格者按一定数量装入专用包装袋中，并做好菌种质量检验记录。

9 包装、标识、储存及运输

9.1 母种的包装、标识、储存及运输

母种的包装为试管，试管外应贴有标注编号、接种时间、生产批号、生产单位等内容的标签。母种检验合格后，应置于4℃冰箱保存条件下进行储存，储存保质期的菌龄＜30 d。

运输母种的外包装为清洁、干燥的纸箱或专用铁箱，装箱时应使用清洁、干燥的碎纸条填充试管间的空隙，使其固定。包装外应贴有标注茯苓母种、生产批号、生产单位等内容的专用标签。

茯苓母种的运输工具应清洁、干燥，不能与有毒、有害、有异味的物品混装，运输过程中应注意防震、防潮。

9.2 原种的包装、标识、储存及运输

原种的包装为广口菌种瓶或聚丙烯塑料菌种袋，瓶或袋外应贴有标注编号、母苓来源、接种时间、生产批号、生产单位等内容的标签。

原种检验合格后，应及时使用，或置于10～25℃的常温培养室内储存。储存期间应按时进行抽样检查，及时剔出不合格品，并认真作好菌种储存及抽样检查记录。原种储存保质期的菌龄＜45 d。

运输原种的外包装为清洁、干燥的专用纸箱或编织袋，箱（或袋）内应排放整齐，不留空隙，使其固定。包装外应贴有标注茯苓原种、生产批号、生产单位等内容的专用标签。

茯苓原种的运输工具应清洁、干燥，不能与有毒、有害、有异味的物品混装，运输过程中应注意防震、防潮。

9.3 栽培种的包装、标识、储存及运输

栽培菌种的包装为聚丙烯塑料菌种袋，袋外应贴有标注编号、原苓来源、接种时间、生产批号、生产单位等内容的标签。

栽培菌种检验合格后，应及时使用，或置于10～25℃的常温培养室内储存。储存时，应将菌种按一定数量装入专用包装袋中，单层置于货架或垫板上，码放整齐，不得叠放，以免使菌种局部温度过高，导致衰亡。储存期间应按时进行抽样检查，及时剔出不合格品，并认真作好菌种储存及抽样检查记录。栽培菌种储存保质期的菌龄＜60 d。

运输原种的外包装为清洁、干燥的专用纸箱或编织袋，箱（或袋）内应排放整齐，不留空隙，使其固定。包装外应贴有标注茯苓栽培菌种、生产批号、生产单位等内容的专用标签。

茯苓栽培菌种的运输工具应清洁、干燥，不能与有毒、有害、有异味的物品混装，运输过程中应注意防震、防潮。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：224-225.

[2]娄隆后，朱慧真，周璧华.食用菌生物学及栽培技术[M].北京：中国林业出版社，1984：9.

[3]中国药材公司.中国常用中药材[M].北京：科学出版社，1995：1076-1085.

[4]付杰，王克勤，方红，等.茯苓药源及生产栽培现状[J].中药研究与信息，2002，4（2）：24-25.

“十二五”国家科技支撑计划项目——茯苓规范化种植基地优化升级及系列产品综合开发研究（2011BAI06B03）

*王克勤，E-mail：hbwhwkq＠163.com

2011-10-08）