纳米载体在胶质瘤成像中的应用

张振宇徐健钟平

·综 述·

纳米载体在胶质瘤成像中的应用

张振宇*徐健*钟平*

纳米载体 胶质瘤 成像 磁共振

大部分胶质瘤具有浸润生长的特点，是癌症治疗领域的一大难题。有资料［1］显示，在联合了手术、放疗、替莫唑胺化疗等治疗后，胶质母细胞瘤患者的平均生存期也只有19.6个月，是预后最差的恶性肿瘤之一。由于血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的存在使许多造影剂不能达到胶质瘤所在部位，故早期诊断困难［2］。术中肿瘤边界难以确定，完全切除率低，以致复发率高。近年来，关于纳米颗粒（nanoparticle，NP）的研究在很大程度上推动了胶质瘤成像和示踪技术的发展。NP是一类大小介于10～1000 nm的固体胶状颗粒，虽然NP在机体内的吸收、分布、代谢、排泄和毒性尚未明确，但NP作为对比剂、化疗药物的载体具有穿透BBB、特异性结合于肿瘤细胞、减少体内毒副反应、增加药物生物相容性、延长药物半衰期、降低肿瘤耐药性等优点，因此成为胶质瘤诊断、治疗研究中的前沿热点之一。

1 纳米载体概述

1.1 纳米载体分类 纳米载体种类繁多，铁氧化物纳米颗粒、量子点（quantum dots，QDs）、上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles，UCNs）等纳米载体本身就具有成像作用，有些纳米载体（如共聚物胶束、树形聚合物、脂质体等）则需携带对比剂才具有成像作用。

铁氧化物纳米颗粒由赤铁矿（Fe3O4）或磁赤铁矿（γ-Fe2O3）纳米晶体构成核心，外覆聚合物分子、右旋糖酐、淀粉等组成，其根据大小分为超顺磁性铁氧化物（SPIO）和超小超顺磁性铁氧化物（USPIO），前者大小一般在50～150 nm之间，易被单核巨噬细胞吞噬，而后者粒径一般在40 nm以下，可逃避巨噬细胞的吞噬，使其血浆半衰期延长，更适用于胶质瘤的显像［3］。它们降解以后，铁离子贮存在体内，最终作为造血原料被消耗，体内使用安全。

共聚物胶束是由双亲性嵌段共聚物在水溶液中自体组装形成的球形分子，直径20～50 nm。亲水性的头段朝外与水溶液接触，疏水性的尾段朝内，疏水性是其自组装的动力［4］。常用的聚氧化乙烯（polyethyleneoxide，PEO）胶束容量大，稳定性好，能避免被网状内皮系统（RES）清除。

树形聚合物由从一个或几个核心发出重复的不断分枝的树枝状多聚物分子骨架层层叠加组成，每增加一层就增加一代（G）。在分枝之间可以夹带对比剂，也可在表面的末级分枝尾端偶联荧光剂和靶向分子。常用的有聚酰胺-胺树枝状聚合物（PAMAM dendrimer）。

QDs是在半导体纳米晶体核心（锡化镉，CdSe）外加一层钝化外壳（硫化锌，ZnS）形成，表面可再加一层多聚物分子以连接靶向分子。QDs的核心决定荧光颜色，外壳增加亮度及稳定性。QDs既是纳米载体又具有显像作用，但QDs重金属核心的毒性及对暗手术野的要求是其应用于临床的主要障碍［5］。

UCNs由晶格基质（如氟化钇钠，NaYF4）内掺激发剂（如铒、铥、釔）、敏化剂（如镱）组成。敏化剂吸收低能量的近红外光并将能量传递给激发剂，使其发出高能量可见光［6］。上转换荧光的近红外激发光谱能非侵袭性地穿透深部组织，发射光线清晰可见，而周围组织无自发荧光产生，形成鲜明的对比［7］。

脂质体是以单层或双层磷脂双分子层包膜为主体，在包膜的液态空腔中可装载对比剂、荧光剂，其表层磷脂分子上可连接靶向分子［4］。在磷脂层外再加亲水性多聚物包层，还可以形成立体稳定脂质体（SLs）。作为最早使用的纳米载体，脂质体良好的生物相容性能显著改善药物的药代动力学特性［8］。

1.2 纳米载体结构 一般来说，一个较完整的纳米载体包括核心、外壳以及靶向部分。核心是纳米载体所携带的使胶质瘤细胞显像的效应部分，主要有铁氧化物 （SPIO、USPIO）、钆（Gd）以及荧光染料等。外壳一般由亲水性聚合物或表面活性剂组成。在电解质溶液中，NP表面电荷被中和，粒子间的静电斥力减弱，易导致粒子聚集；未经修饰的NP在血液中还易与血浆蛋白及调理素结合，随之被RES吞噬降解，使半衰期缩短。在NP表面包被一层亲水性的聚合物分子，如聚乙二醇（PEG）等，通过改变NP的表面性质解决了这两个问题，同时还为NP进一步连接配体提供了末端基团。靶向部分使纳米载体对胶质瘤细胞有特异结合作用或提高纳米载体穿透BBB的能力，目前常用的靶向分子有：①肿瘤细胞表面受体的配体如转铁蛋白（Tf）、乳铁蛋白（Lf）、叶酸；②抗体如 CD105mAb、EGFRmAb；③肽段如氯代毒素 （CTX）、酰化聚精氨酸多肽（MPAP）、F3肽段；④核苷酸配适子等。

1.3 与传统对比剂相比纳米载体的优点 传统的钆螯合剂易向周围组织间隙扩散，不能在肿瘤部位浓集，导致肿瘤边界模糊。而载对比剂纳米载体则可通过细胞内化作用减少扩散，延长显影时间，实现一次造影术前、术中、术后多次显影［9］。

在血液循环中，直径大于150 nm的颗粒易被RES吞噬，小于 20 nm则易被肾脏滤过［10］，因此传统对比剂血浆清除率高，半衰期短。而NP的直径却可人为选择、调节使之介于两者之间，且包被PEG能增加其亲水性、提高其生物相容性，减少降解，延长体内循环时间。

NP的活性表面为连接特异性靶向分子提供了可能。无论是肿瘤细胞特异性的、肿瘤新生血管特异性的、还是BBB特异性的分子，都能提高NP的选择性定位能力。

Gd做对比剂时，对人体有明显毒副作用，如假性低钙血症、免疫反应、造影剂肾病等［11］。载对比剂纳米载体基于其清除率低、选择性高等优点可以减少使用剂量，且纳米载体将对比剂与血液隔离，降低了其毒性。

2 纳米载体在胶质瘤成像研究中的应用

先进的治疗手段离不开先进的检测方法，胶质瘤的治疗也不例外。纳米载体凭借其诸多优势能够更精确地显示胶质瘤的边界，为完全切除肿瘤提供了条件。另外，纳米载体的研究也推动了在细胞、分子水平示踪胶质瘤、治疗胶质瘤策略的发展。

2.1 在MRI中的应用

2.1.1 确定手术边界 与游离对比剂相比，载对比剂NP可被吞噬到肿瘤细胞内，所以不会因手术损伤BBB而使NP扩散和引起肿瘤边界模糊。被吞入细胞的NP在胞内停留时间长，因此术前检查所注射的载对比剂NP亦可用作术中MRI成像，省去了术中再使用对比剂的麻烦，为区分术中残余肿瘤和正常脑组织提供了参考，有助于更完整地切除肿瘤。Xie等［12］将靶向配体Lf连接到SPION上，合成Lf-SPIONs作为MRI对比剂。Lf属于转铁蛋白家族，其受体在BBB毛细血管内皮细胞和胶质瘤细胞表面均高表达，因此连有Lf的SPION可经受体介导的胞吞作用通过BBB并进入肿瘤细胞内。小鼠胶质瘤模型证实与SPION相比，Lf-SPIONs能使肿瘤部位MRI T2相信号更明显地降低，这一效应可持续到静注后48 h，而Gd则会在半小时内扩散到周围脑组织中，所以Lf-SPIONs在MRI上的长时间对比效应可能为术中显示肿瘤范围，确定手术边界和评价治疗效果提供新的途径。

2.1.2 检测新生血管 胶质瘤是血供最丰富的肿瘤之一，区别新生血管和宿主已存血管对决定是否使用抗血管新生药物、评价治疗效果尤为重要。Zhang等［13］考虑到内皮因子（CD105）在胶质瘤周围及内部的新生血管内皮细胞中高表达，正常血管内皮细胞中却很少表达的特点，通过CD105单克隆抗体（CD105mAb）将装载Gd的立体稳定脂质体（SLs）靶向定位到F98胶质瘤小鼠的肿瘤新生微血管，做为检测胶质瘤新生血管、评价肿瘤进展及监测抗血管新生治疗效果的MRI对比剂。

某些干细胞能分化为血管内皮细胞参与胶质瘤的血管新生过程，以NP标记这些干细胞，则能通过MRI在体外示踪肿瘤的新生血管。Anderson等［14］用多聚赖氨酸（PLL）包裹超顺磁性氧化铁Ferumoxide组成FE-PLL纳米颗粒体外标记小鼠Sca1＋骨髓干细胞，然后将这些细胞注入颅内荷胶质瘤的小鼠体内，定期进行MRI检查，发现肿瘤内部出现进展性低信号影，肿瘤边缘出现持续性低信号环状影。组织学结果显示肿瘤边缘FE-PLL NP标记的干细胞有CD31和vWF因子表达，提示这些细胞已分化为内皮样细胞。有研究者［15］将以SPIO标记的间充质干细胞注入颅内荷胶质瘤的大鼠体内，分别在其后7 d及14 d行MRI检查，第7 d低信号区分散在整个肿瘤内部，第14 d低信号区则位于肿瘤边缘，反应早期全部肿瘤均有高度血管新生，晚期新生血管则主要分布在不断生长的边缘部位。

2.2 在光学成像中的应用

2.2.1 确定手术边界 与MRI不同，光学显像不会使病灶的空间分辨率下降，能为术者提供实时可靠地肿瘤定位信息。目前临床常用的光学成像剂是δ-氨基-γ酮戊酸（5-ALA）衍生物原卟啉IX（PpIX）。但随着浸润生长的肿瘤细胞逐渐减少，肿瘤边界处荧光强度逐渐减弱，且荧光物质不仅出现在肿瘤间隙，也出现在正常脑组织间隙，使得术者对肿瘤浸润程度的判断产生误差。荧光染料NP和QDs等以纳米载体为基础的成像剂则凭借其吞噬显影和高选择性的特点表现出明显优势。Jackson等［16］将QDs经尾静脉注入颅内植有C6胶质瘤细胞的大鼠体内，24 h后处死大鼠并行全脑荧光成像，观察到肿瘤原病灶和远处转移卫星灶，后经HE染色和紫外显微镜证实两荧光部位均有肿瘤细胞和QDs。他们的研究发现大剂量QDs在机体内被巨噬细胞和小胶质细胞吞噬，这些吞噬了QDs的细胞迁移到胶质瘤细胞周围从而使肿瘤显像。而Arndt-Jovin等［17］则在此基础上将表皮生长因子 （EGF）和表皮生长因子受体（EGFR）连接于QDs上以加强其对肿瘤细胞的选择性，并提出可以在切除肿瘤形成的空洞内填塞被QD探针溶液浸湿的棉垫，15 min后便能使空洞壁上的残存肿瘤细胞获得QD探针足够的标记，避免了经静脉途径QD探针在肝脾的滞留。

但荧光染料NP和QDs都需要特殊的成像设备与技术，特别是对暗视野的要求加大了显微神经外科手术的难度，因此理想的光学成像剂应该具备能在正常手术照明条件下显像的性质。于是有学者［18］将考马斯蓝（coomassie blue，CB）、亚甲蓝、吲哚菁绿分别装载于聚丙烯酰胺 （polyacrylamide，PAA）纳米颗粒，然后将分别与3组9L胶质瘤细胞孵育，洗涤后3组细胞均被染色，在正常光照条件下其颜色改变足够与正常脑组织区别。以CB染色效果最好，他们又在CB-NP上连接靶向分子F3肽段，与非靶向CB-NP相比更易被9L细胞内化，他们提出F3-CB-NP将来有可能用于术中裸眼下确定肿瘤边界。此外，上转换纳米颗粒作为新一代用于胶质瘤成像的纳米探针，有着毒性小、肉眼下直接成像等优势，因而受到研究者的重视。Yu等［7］制备了CTX共轭的NaYF4：Yb，Er／Ce上转换纳米探针（CTXUCNP）。经静脉注入皮下植有胶质瘤的裸鼠体内，在持续近红外激发光谱的照射下，肿瘤发出肉眼可见的红色荧光。真彩成像经软件处理得到假彩成像，显示肿瘤周围荧光信号呈不规则分布，说明肿瘤可能已扩散，可为决定切除范围提供参考。

2.2.2 探测肿瘤分子标志 一些胶质瘤特异性表达的分子对于其诊断、分型、治疗及预后评价均有显著意义，QDs以其独特的光学优势在分子显像中发挥重要作用。Wang等［19］将QDs通过亲和素-生物素作用与EGFR抗体结合，制备了可用于术中识别胶质瘤标志物EGFR的荧光探针。将探针分别与胶质瘤细胞孵育，通过荧光显微镜观察到探针在15 min内高度特异地结合到细胞膜上，结合量与细胞膜上表达的EGFR水平有关。他们还以同样的方法将收集到的GBM、少突胶质细胞瘤及正常脑组织标本与探针孵育，观察到仅肿瘤标本在30min内被标记。说明标记QDs的EGFR抗体能快速准确地显示肿瘤分子标记物EGFR，故有可能取代过去术中快速冰冻切片的标准病理诊断，提供更迅速准确的术中诊断。同时缩短了术后等待免疫组化染色结果的时间，为决定术后是否使用EGFR抑制剂辅助治疗提供了依据。

2.3 多功能纳米探针 多功能纳米探针是指能被两种或两种以上成像系统检测到的NP，可同时具有MRI对比剂和光学成像剂的功能，通过不同成像体系的互补呈现出更准确的图像。2003年，Kircher等［20］合成了一种多功能磁性纳米颗粒 Cy5.5-CLIO（Cy5.5-Crosslinked iron oxides），其核心是铁氧化物，外面包裹着连接有荧光染料Cy5.5的交联右旋糖酐，铁氧化物是术前MRI对比剂而Cy5.5是术中荧光显像剂。传统MRI对比剂Gd属于小分子物质，易经肾清除，而Cy5.5-CLIO则能长时间存在于血液循环。Cy5.5-CLIO的近红外荧光（NIRF）足够强，可穿透几毫米厚的组织，定位时间短至500 ms，便于术中迅速识别肿瘤边界。术前经大鼠尾静脉注入后，Cy5.5-CLIO被肿瘤细胞内化，术中不会扩散到细胞外的组织间隙，故术中荧光成像得到的边界与术前MRI得到的边界具有可比性，有利于提高手术切除的精度。他们还使9L胶质瘤细胞经过转染表达绿色荧光蛋白（GFP），Cy5.5-CLIO光学成像得到的边界与GFP光学成像的边界相比平均只有2～24 μm的差距，说明Cy5.5-CLIO能准确描绘肿瘤边界。较近的报道如Wan等［21］将由多个Fe3O4纳米颗粒组成的磁性纳米颗粒簇（MRI对比剂）和异硫氰基荧光素（FITC，光学成像剂）同时装入硅外壳中组成磁荧光纳米颗粒（MFNPs），并在其表面连接上靶向分子CTX。体外实验表明，CTX-MFNPs的横向弛豫为游离Fe3O4纳米颗粒的2.54倍，能更有效地降低T2信号；与游离FITC相比具有更好的光稳定性，其荧光强度能持续几个月无改变；加之CTX-MFNPs可以在CTX的引导下经受体介导的胞吞作用被胶质瘤细胞特异性摄取，因此有望用于胶质瘤的临床诊断。

3 总结

目前虽已研制出许多纳米成像剂，但其研究多处于试验阶段，真正用于临床的并不多，故需加快纳米载体应用于胶质瘤成像与示踪的进程。SPIO、USPIO、QDs、UCNs等NPs有可观的研究前景，特别是以之为基础的多功能纳米载体的开发对于解决手术中的一些实际问题意义重大。关于NP对人体可能存在的副作用尚存在争议，亟需更进一步的研究。正如美国国家科学基金主任RColwell所言 “纳米技术确实是通向新世界的一扇门”，纳米载体的不断发展也必然会使胶质瘤在成像、示踪研究方面实现突破。

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R651 （

2010－05－30）

A （责任编辑：甘章平）

* 复旦大学附属华山医院神经外科（上海 200040）