血管内皮生长因子的调控及其作用研究进展

蔡源源 综述 李光早 审校

血管内皮生长因子 （Vascular endothelial growth factor，VEGF）具有促进血管内皮细胞分裂与增殖，增加微静脉、小静脉的通透性，诱导丝氨酸蛋白酶和间质胶原酶的表达，使细胞质钙聚集，诱导血管生成，在创伤愈合、胚胎发育、肿瘤生长和转移过程中起着重要的作用。

1 VEGF及其受体

VEGF是由二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，能与肝素结合，相对分子量34～45 KDa，NH2末端有特异的6个极性氨基酸组成的疏水基团，是分泌信号的标志。1983年，Senger等[1]从豚鼠的腹腔肿瘤中分离得到一种蛋白因子，发现它可以诱导血清蛋白由血管渗漏而不引起血管内皮细胞的损伤，称为血管通透性因子（Vascular permeability factor，VPF）， 之后被认为是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，在体内有诱导血管生长、血管形成、内皮细胞增殖迁移，增加血管通透性的作用。人的VEGF基因位于染色体6p21，基因全长28 Kb，编码基因长14 Kb，由8个外显子及7个内含子构成[2]。编码产物为同源二聚体糖蛋白，等电点为8.5，有很强的耐热和耐酸能力。

VEGF是血小板衍生性生长因子（PDGF）家族的成员，其结构与PDGF-β链部分相同，有18%序列相符。PDGF/VEGF家族成员的共同结构是8个保守的被间隔的半胱氨酸残基位于核心结构，通过8个保守的半胱氨酸的第二和第四之间的二硫键形成同源二聚体，这些结构对二聚化和生物活性至关重要。VEGF是一种多功能的细胞因子，可由内皮细胞、平滑肌细胞和一些间质细胞分泌。

已发现 VEGF 家族包括 7 个成员，VEGF-A、B、C、D、E、F[3]和 PIGF（Placeta Growth Factor，胎盘生长因子）[4]。 VEGF-A 发现最早，在组织和细胞中含量最丰富，功能最强，故多数文献中的VEGF即指VEGF-A，它是以二硫键相连的寡二聚体糖蛋白，经不同剪切方式可以7种不同的亚型出现，即VEGF121、145、165、183、189和206。 VEGF165是最主要的同分异构体[5]。各亚型与肝素的结合能力、生理活性和作用各不相同[3]。VEGF121不与肝素结合，为可溶性分泌蛋白，分泌后较弥散；VEGF165的50%以分泌型存在，其余则与包膜上含硫酸乙酰肝素的蛋白多糖结合，具有很强的促进内皮细胞分裂增殖能力，在实验和临床中研究较多。各种VEGF亚型中VEGF165便于肌注和静脉注射，一方面是因为具有可溶性，另一方面它可与蛋白多糖结合，作用时间较长，且诱导血管内皮细胞增殖的活性最强。VEGF-B基因定位于染色体11q13，主要在心肌等组织中表达，并且分布于绝大部分肿瘤中[6]。VEGF-C基因定位于染色体4q34，主要在心脏、胎盘等组织中表达，VEGF-B、C被认为与淋巴管的发育有关，肿瘤细胞特异性的表达2.4 KDa的VEGF-C mRNA，可能与肿瘤的淋巴转移有关。VEGF-D基因定位于染色体Xp22.31，全长50 Kb，由6个内含子和7个外显子组成。VEGF-D经过与VEGF-C相同的方式被水解成一种成熟形式分泌出来。主要在心、肺、肠道表达，促内皮分裂作用较弱。VEGF-E由149个氨基酸组成，其结构与VEGF121相似，缺乏碱性区与肝素结合区[7]。PIGF基因定位于染色体2p16～21，有PIGF-1和PIGF-2异构体，目前研究较少。

血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）是VEGF特异性的膜受体，具有高亲和力，属于酪氨酸激酶亚家族中的一个成员。作为一种典型跨膜镶嵌蛋白，分为胞外区、跨膜区及膜内区3部分，以胞外7个免疫球蛋白样的超二级结构、胞内2个间开的酪氨酸激酶区为其特征。VEGF家族受体有：①Fam样酪氨酸激酶受体（Flt-1/VEGFR-1），主要与内皮细胞的形态及调节有关[8]；②激酶插入域或胎肝激酶受体（KDR/Flk-1/VEGFR-2），主要调节内皮细胞的分裂、增殖及血管通透，主要参与血管形成过程[9]；③VEGFR-3/Flt-4，激活该受体主要引起淋巴管内皮细胞增生。

2 VEGF及其受体的表达

尽管在健康的器官中一般没有血管增殖，但VEGF起着维持原有血管密度，以及维持所必需的通透性而运输营养物质的作用。VEGF基因的表达受缺氧、多种细胞因子，类固醇激素，瘤基因，抑瘤基因产物及一些小分子物质等因素的调控。目前认为，缺血或缺氧是诱导VEGF表达的最主要因素，VEGF能随氧浓度的变化迅速上调达10倍以上。VEGF可表达于成纤维细胞、角朊细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等，其主要生物学功能就是促进血管形成。VEGF在成熟器官中表达较低，在一些代谢旺盛、血供丰富的组织细胞中，如肾小球足突细胞、前列腺上皮细胞、心肌细胞、精子细胞、肾上腺皮质细胞等，VEGF的表达较高。

VEGF与组织器官的发育密切相关。胚胎组织、胎盘、增殖期的子宫内膜、黄体等，由于生长发育和血管生成的需要，VEGF的表达呈较高水平[10]。对生理过程的影响主要体现在雌性的月经周期变化中对子宫内膜修复，及其在卵巢和黄体生成过程中对生育功能的影响。

VEGF在肿瘤生长及转移、创伤愈合、牛皮癣、迟发性过敏反应和增生性瘢痕、瘢痕疙瘩等病理过程中可过量表达[11]。瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的形成与角朊细胞中VEGF过度表达或许有密切关系，其机制可能是VEGF通过旁分泌机制作用于血管内皮细胞，在真皮内诱导生成大量新生血管，并能通过某种机制调节成纤维细胞的活性[12]，影响胶原代谢。同时，组织的缺氧也可刺激细胞分泌VEGF[13]。肿瘤的生长和转移需要得到充足的营养物质，故而对血管生成具有特异性促进作用的VEGF成为肿瘤研究的热点。研究表明，VEGF参与了体内的特异性与非特异性炎症反应，并成为与视网膜新血管和视网膜病变相关的重要因子。

VEGFR主要在内皮细胞中表达，其他细胞中也可表达其中一种或两种受体。除VEGFR-3分布于淋巴内皮细胞外，VEGFR-1、VEGFR-2主要在血管内皮细胞表达。VEGFR-1能在肾小球系膜细胞、单核细胞以及滋养层细胞等处表达；而造血干细胞、巨噬细胞、视网膜前体细胞则能表达VEGFR-2。这两种受体均具有酪氨酸激酶活性，与VEGF结合具有特异性。正常组织中VEGFR一般呈低表达，但在特殊的生理及病理过程中，VEGFR可表达上调，如肿瘤或创伤等。在月经周期，VEGFR表达也可增高。在许多种肿瘤组织血管内皮细胞中其表达均可上调.应用RT-PCR技术，在卵巢癌和黑色素瘤细胞中测到KDR mRNA，提示VEGFR也可表达于肿瘤细胞，VEGF可通过旁分泌及自分泌途径作用于肿瘤细胞受体。

3 VEGF表达的调控因素

VEGF的表达调控机制目前尚不清楚，一些细胞因子对VEGF的表达有正调节作用[14]。同时，缺氧状态可以诱导刺激VEGF的表达。此外，蛋白激酶C、雌激素腺苷酸环化酶激活剂，以及双氧水、紫外线也可诱导产生VEGF[15]。

3.1 细胞因子

肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白细胞介素-1、表皮生长因子、前列腺素E等，均能使VEGF及其受体表达上调，提高其生物学活性[16]。实验证实，bFGF和VEGF联合使用，会明显提高血管再生的速度及生成血管的直径，同时大大提高了缺血肢体的血供[17]。TNF-α能使体外培养的内皮细胞发生迁移和管状生长，但较低的剂量有明显的促进血管生成的作用，而高剂量时则表现为抑制作用。把神经胶质瘤细胞和TNFα一起培养后发现，VEGF和VEGF基因启动子SP-1区的RNA表达增高，其增高幅度为单独孵化神经胶质瘤的5倍，证明TNFα的血管生成作用还和激活VEGF基因启动子sp-1区有关。

3.2 缺氧

缺氧条件下机体组织VEGF表达上调，VEGF合成增多，其作用机制可能为：①缺氧诱导因子（HIF-1）诱导启动VEGF的转录，HIF-1受氧气和生长因子的调节，可以激活正常的缺氧感受基因，HIF-1可以在数分钟内使VEGF增加30倍，从而调控VEGF表达[18]；②在缺氧环境下培养细胞，结果发现细胞内VEGF的表达及mRNA水平明显增高，提示缺氧可导致VEGF的表达及释放，并且是促血管生成的因素之一[19]。③缺氧使得一种核内核糖蛋白与VEGF mRNA非翻译区的富含Au元件形成RNA-蛋白复合物，可显著延长VEGF mRNA在体内的半衰期，从而间接提高VEGF的生理活性[20]。

3.3 血小板

血小板在VEGF的产生及调节中起重要作用。将人血小板和凝血酶在体外孵化，发现有大量VEGF产生。活化的血小板能释放VEGF，这对创伤愈合及其他病理条件下的血管形成具有重要意义。研究认为，血小板和损伤的血管壁接触可激发凝血机制，导致VEGF释放。另外，Salgado等[21]在对恶性肿瘤的血液标本检测时发现，VEGF浓度是正常的3.2倍，这一结果支持血小板具备储存有生物活性的VEGF的作用。

3.4 其他

一些原癌基因和抑癌基因的表达产物，以及类固醇激素、交感神经也可以调控VEGF的表达，如促甲状腺激素可通过旁分泌机制促进甲状腺细胞合成、分泌VEGF；野生型p53基因通过与转录因子SP-1结合，可下调内源性VEGF mRNA，并抑制VEGF启动子活性，而重组p53基因无此作用。

4 VEGF生物学作用

4.1 促进血管生成作用

VEGF最主要的生物学作用是可以促进动脉、静脉，以及淋巴管来源的内皮细胞的生长[22]。自身内源性的VEGF是机体组织损伤恢复重要的血管生长因子，Wagatsuma[23]通过动物实验证实，肌肉损伤后早期VEGF及其受体的mRNA表达明显增高，与损伤早期的血管化程度密切相关，从而也间接说明了VEGF的重要的血管化作用。治疗性血管生长素是治疗缺血性血管疾病的一个新概念，它包括诱导血管发生、小动脉生成及淋巴管生成[24]。在血管生长中，VEGF调节内皮细胞胞外基质溶解、内皮细胞迁移、增生和管腔形成。其过程主要包括以下步骤[25]：①血浆的外渗，新生血管外基质的构筑；②新生血管芽雏形的形成；③血管芽的发育和扩展；④新生血管的成熟和改建。VEGF通过增加血管通透性，使血管内纤维蛋白原等血浆蛋白外渗，纤维蛋白原与血管外渗纤维连接蛋白等多种成分凝结形成交叉的纤维蛋白凝胶体，为内皮细胞、成纤维细胞的迁移提供一个纤维网络，有利于血管生成。VEGF在多种在体模型中的促血管生成作用已经被多个实验所证实[26]。此外，还有许多的体外和在体实验表明，VEGF是血管内皮细胞的生存因子，Maharaj等[27]认为低水平生理量的VEGF-A是维持血管稳定所必需的。在体外实验中，Gerber等[28]发现VEGF是通过PI-3激酶-Akt通路发挥抗凋亡作用的；VEGF可以诱导内皮细胞内Bcl-2，Bcl-A1等抗凋亡蛋白的表达，从而起到抗凋亡作用。体外细胞培养发现，VEGF与内皮细胞受体结合后，可立即引起钙离子内流。数秒内细胞内钙离子增高4倍以上，并且刺激三磷酸肌醇的累积，表明其通过激活磷脂酶C而起作用[29]。体内实验表明，VEGF对于机体的发育也是必不可少的，如抑制VEGF的作用，可以使新生鼠的血管发生显著的凋亡改变，而成年鼠则没有类似改变。Benjamin等[30]对肿瘤研究发现，新形成血管的内皮细胞对VEGF具有强烈的依赖性，而已经存在的、成熟的血管对VEGF的依赖性则较弱；认为这种依赖性下降的主要原因是由于外皮细胞或周细胞的覆盖所致。

4.2 提高血管通透性

VEGF增加毛细血管后静脉和小静脉的通透性，主要作用于毛细血管后静脉，在几分钟内即可增加血管对血浆蛋白的通透性，在已知的微血管通透性诱导物中作用最强，效应是组织胺的5万倍。通过超微免疫组化定位后发现，VEGF结合在微血管内皮细胞的管腔外侧面和一种被称为囊-泡小体（VVO）的细胞器上[31]。VVO横跨在内皮细胞管腔的内侧面至外侧面，是内皮细胞的胞质中一些囊、液泡组成的葡萄簇样结构。囊、液泡直接由三层单位膜相连，此外还有一个由隔膜组成的可开闭的小孔。当孔打开时，血液中的大分子物质从相互连接的囊泡液中通过，进入周围的组织间隙中。血管内皮细胞的基底膜面和VVO中有结合的VEGF，局部注射VEGF后可观察到VVO的功能增强[32]。VEGF引起血管通透性增加，导致血浆蛋白广泛的外漏，其中包括凝血因子、纤维蛋白原、纤维黏连蛋白、血浆酶原等[33]。这些蛋白直接或间接改变了细胞外基质成分，使其形成暂时性的新基质，允许并支持内皮细胞和成纤维细胞内向移动，迁移到成纤维细胞合成和分泌基质蛋白、蛋白聚糖，内皮细胞形成新的血管，共同构成新生肉芽组织，修复创伤。

4.3 其他作用

虽然血管内皮细胞是VEGF发挥作用的主要靶细胞，但是VEGF也可以作用于其他一些细胞并发挥促有丝分裂作用，例如：肺泡Ⅱ型细胞、淋巴细胞、视网膜色素上皮细胞、雪旺细胞等。此外，VEGF对骨髓来源的细胞也有一定的作用，它能提高单核细胞的趋化性，并通过诱导杆状核-巨噬细胞前体细胞的成熟使克隆形成。此外，VEGF在视网膜血管新生、老年斑退化、风湿性关节炎及牛皮癣发生中均有重要作用[34]。

5 VEGF在创伤愈合中的表达

创伤愈合的关键就是血管生成，已经证实VEGF是最强的促血管内皮细胞有丝分裂原。VEGF作为血管生成的一个重要的调节因素，在创伤愈合研究中占据着特殊的地位。VEGF在正常组织的表达一般较微弱，但在创伤愈合中会有较强的表达。

Corral等[35]对兔耳缺血模型的研究发现，缺血皮肤及缺血创面VEGF mRNA表达均上调，且从损伤后第1天起直至第10天。对大鼠创伤皮肤内VEGF表达的免疫组化研究表明，创伤组于伤后12 h VEGF表达开始增强，以24～48 h表达最强。24～48 h VEGF除在上皮细胞表达外，在巨噬细胞及新生毛细血管内皮细胞内呈强阳性表达。48 h后血管内皮细胞表达渐弱。对急性放射性溃疡的研究证实，辐射损伤的皮肤组织细胞合成分泌VEGF的功能，在溃疡形成前被电离辐射轻度激活，但在溃疡形成后，在辐射和创面的双重刺激下，明显低于单纯创面，不能形成峰值，是溃疡形成、发展及难以愈合的原因之一。

应当指出，仅考虑VEGF的促血管生成作用还不足以完全解释缺血创面应用外源性VEGF后肉芽组织的快速生长，因为bFGF也有较明显的促血管生成作用，但在缺血创面的应用中无明显效果。VEGF还能增加微血管通透性，促进血浆蛋白渗出及细胞迁移至损伤区域，而bFGF则无此特性[36]。另外，VEGF与内皮细胞结合后会释放许多具有生物学活性的生长因子及细胞因子，而bFGF不能。在缺血创面愈合中，VEGF165作用较VEGF121更为突出。VEGF表达的调节机制尚不十分清楚，但一些血清来源和旁分泌的生长因子与细胞因子， 包括 PDGF、EGF、TNF、TGF等都能使培养细胞VEGF表达上调3～20倍，而创伤修复各阶段均有上述因子的表达。其中，bFGF具有直接调节作用，并且与VEGF协同作用明显[37]。创伤早期阶段的局部组织缺氧，对调节创面VEGF的表达具有重要作用。

综上所述，作为体内的最强的促进血管生成的因子，VEGF在创伤愈合、胚胎发育、视网膜血管新生、风湿性关节炎以及肿瘤的生长和转移中都起着重要的作用，同时，很多因素也影响着VEGF的表达和发挥作用。因此，进一步研究VEGF及其影响因素和调控机制，寻找特异性和靶向性强的目的基因和药物，在血管性疾病的治疗中具有重要的意义。

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