细胞抽提物重编程作用的研究进展

唐新杰 综述 谢峰 张群 审校

细胞在发育过程中，特异性地开放或者关闭某些特定基因，可以使细胞产生不同的表观状态。实验证明，通过重编程成熟体细胞的基因形态可以使其表观状态发生改变，也就是说分化的体细胞在特定的条件下能转为另一种细胞形态，此过程被称为体细胞的重编程。细胞抽提物诱导是重编程的方法之一，是指用供体细胞抽提物（Cell extract）作用于受体细胞后，使受体细胞表达供体细胞的特异性基因。本文就细胞抽提物重编程的研究现状、相关机理及存在的问题进行综述。

1 细胞抽提物重编程概述

1.1 细胞抽提物重编程的方法

重编程的方法有多种，如核移植[1-3]、细胞融合[4-5]、分子调控诱导[6-8]以及细胞抽提物诱导等。经典的重编程是将供体细胞核转入卵细胞内，利用卵细胞的胞内微环境对供体细胞基因表达进行重编程，从而使新细胞获得全能分化性，著名的克隆实验就属于重编程。这种重编程效率极低、有卵细胞依赖性、涉及伦理问题等，无法广泛应用。细胞融合是将体细胞同胚胎干细胞 （Embryonic stem cell，ESCs）或胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EGCs）融合后，使之转化为全能细胞，但有效率仅为0.1%～0.3%[9]。分子调控诱导同样也可对细胞进行重编程，如联合应用Oct4、Sox2、c-Myc和 Klf4等基因可以诱导体细胞向多能状态分化，染色体结构发生改变，并表达多能性基因[6]。

细胞抽提物重编程的操作方法是一种比较直接的有效方法。与经典的重编程不同，首先收集供体细胞，加入细胞裂解液，然后在脉冲超声的作用下匀浆，直至显微镜下观察不到细胞结构和细胞核结构，离心后的上清液即是供体细胞的胞浆、胞核抽提物。接下来，用链球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）对受体细胞进行渗透化处理，使其胞膜出现可逆性通道。SLO对黏附和非黏附细胞均具有成孔毒性，处理过的细胞允许小于100 KDa的分子进入细胞[10]。随后，在抽提物与受体细胞的混合物中加入ATP生成系统和合成RNA所需的各种核苷酸NTP后，使抽提物能够进入受体细胞的细胞核。最后用含Ca2+的培养液封闭受体细胞膜通道，继续培养细胞，使其生长、扩增，并表达供体细胞表型。其中，供体细胞抽提物的成分包括细胞质和细胞核的可溶解成分，不包括染色质。

2002年，Hakeline等[12]首次报道应用此技术将T细胞的抽提物转入成纤维细胞内，发现重编程后的成纤维细胞的组蛋白H4乙酰化，染色体结构发生改变，并表达淋巴细胞特有的基因和表面分子标志，在CD3的刺激下，可以合成白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2），这是T细胞特有的反应。同时，报道了应用神经元前体细胞的抽提物，成功使成纤维细胞生长出树突状结构，并表达神经纤维蛋白。

1.2 重编程受体细胞的选择

目前，受体细胞主要是成纤维细胞和成体干细胞，因为这些细胞在体内储量丰富、取材方便、易于分离培养，而且体外诱导条件下都表现出多向分化潜能，都可以分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞等[13-16]，这为体细胞重编程后的分化提供了理论支持。最近有研究表明，在特定的转录因子诱导下，角质形成细胞比成纤维细胞更容易去分化为多能干细胞，有效率约为成纤维细胞的100倍，且角质形成细胞重编程后的细胞的生长速度是成纤维细胞的2倍[17]。在抽提物对体细胞的重编程中，角质形成细胞是否具有同样的优势，尚待研究证明。

2 细胞抽提物重编程的作用机理

细胞抽提物重编程的机理尚不明确。目前普遍认为是供体细胞抽提物中的某些物质启动了受体细胞中某些特异性基因的转录控制基因[18]，从而使受体细胞重编程为供体细胞。Hakelien等[12]认为抽提物中的有效成分可能是转录因子或者DNA结合蛋白，实验证明，无论在T淋巴细胞对成纤维细胞的重编程，还是在胰岛B细胞抽提物对成纤维细胞的重编程，均观察到细胞核对相应IL2基因或Ins基因转录因子的摄取。而且，热处理过的抽提物均没有重编程能力[9，12，18]。

目前的实验研究中都出现了目的基因启动子上的组蛋白H3、H4的乙酰化和（或）甲基化状态及DNA的甲基化状态的改变。细胞DNA的CpG部位甲基化后可抑制多能性胚胎基因表达，是促进细胞的分化和生长的必备环节，ESCs抽提物处理成纤维细胞后，80%的CpG部位发生去甲基化[20]。目的基因启动子上的组蛋白H3、H4的乙酰化增强和甲基化减弱[9，18-21]，但有研究表明这种改变是暂时的[20]。 众所周知，RNA聚合酶Ⅱ结合至启动子是转录起始的关键。组蛋白结构的变化引起细胞的染色质结构发生改变，从而募集RNA聚合酶Ⅱ结合至染色体上多能性基因的转录调节部位，进一步转录出多种相关基因。

细胞抽提物重编程方法表明，分化的细胞在特定的条件下能分化为另一种细胞形态，同时表明细胞重编程后未必回归胚胎状态，而是能直接赋予细胞以新的形态。以往观察到的转录因子的改变或者DNA结合蛋白的改变，可能是重编程的始动因素，也可能是重编程复杂环节中的一环。目前，细胞质内物质（如线粒体等）对细胞遗传分化的影响逐渐成为研究热点[22-25]。体细胞重编程的始动物质、重编程的机制等问题尚无明确答案。但是，细胞抽提物的重编程模式已被证实是一种有效模式，抽提物可以直接进入受体细胞，而且含有重编程所必须的物质，在不了解机理的前提下，仍然可以进行高效重编程。

3 细胞抽提物重编程作用的研究现状

Gaustad等[19]用大鼠心肌细胞抽提物处理人脂肪干细胞，3周后，40%的脂肪干细胞变成多核细胞，在培养过程中观察到细胞有自动节律性。同时，部分细胞表达α-肌动蛋白、连接蛋白43、肌钙蛋白等心肌细胞特有的表面蛋白，并表达分化细胞特有的核纤层蛋白A/C（Lamin A/C）。此外，在重编程过程中，处于G1期的细胞数量减少，细胞的增殖能力减弱。Hakelien等[18]将胰岛素瘤INS-1E细胞提取物转入渗透化处理过的成纤维细胞,成纤维细胞变为圆形，胞体和核变小。Insulin、Pdx1基因的表达在培养早期可检测到，维持7～9 d后表达减弱直至消失。用胰岛素抗体可以检测到细胞内胰岛素蛋白的出现。但在葡萄糖的刺激下，细胞没有出现胰岛素分泌现象。Bru等[20]用小鼠胚胎干细胞抽提物转入人293T细胞。Lamin A/C逐渐消失，1～8 h后表达干细胞特有的与多能性相关的基因 Nanog、Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，这些基因的表达在培养过程中持续表达并逐渐加强，说明基因可以发生长期重编程。培养48 h后这些基因表达的强度与ESCs相差较多，表明ESCs的抽提物启动了293T细胞向多能性状态的改变，但是没有完全分化为ESCs。Rajasingh等[9]将小鼠的ESCs抽提物转入成纤维细胞中，3 d后成纤维细胞的形态开始向ESCs变化，10 d时即形成ESCs样克隆；4周后，重编程的细胞高效表达 Oct4、Nanog、SSEA1、SCF 和 c-Kit等 ESCs标志物，并且在体外诱导条件下，细胞可以向心肌细胞、内皮细胞、神经元细胞和脂肪细胞分化。将CM-DiI标记的重编程后的细胞应用至小鼠下肢缺血模型，术后7 d、10 d、14 d观察，缺血下肢的灌注明显增强，毛细血管密度显著增加，移植的细胞分化为血管内皮细胞和骨骼肌细胞。应用携带GFP基因的慢病毒转染重编程的细胞后，对急性心肌梗死小鼠进行心肌注射后发现心肌纤维化部位明显减少，左心室无显著扩张，心肌收缩功能较好，梗死部位边缘组织的毛细血管密度明显增加，移植的细胞转化为心肌细胞和血管内皮细胞。

4 细胞抽提物重编程目前存在的问题及应用前景

4.1 重编程的有效率

根据文献说明，细胞抽提物重编程的最高的有效率为90%[12]，但是在重编程过程中需要连续更换多种试剂和培养液，这样就导致增殖细胞的选择性培养，无法准确估计重编程细胞的比例。而且，长期的培养过程使得系统分析与重编程有关的因子及作用的难度增大。因此，以简单高效的方法来实现细胞抽提物重编程，是需要进一步研究的。

4.2 新基因表型的维持

在抽提物处理细胞后，8 h内即可检测出目的基因的表达[20]。目的基因的表达会在高峰期开始下降。有文献表明，重编程数月后还可以检测到新表型的表达[11]，新表型的维持时间与受体细胞的类型和抽提物的来源有关。如何使重编程后的细胞最大化且持久地维持新表型，是今后研究的重点方向之一。

4.3 重编程后的细胞与目的细胞的差异性

重编程受多种因素的影响，如细胞所处的环境变化、周围组织细胞分泌的因子的影响、受体细胞自身的可调节性等。目前，尚无证据表明重编程的细胞可以分化至与供体细胞完全相同的形态，在某些基因的表达上，两者存在明显的差异[20]。所以，需要探索新的实验方法来调节受体细胞，使其达到完全转分化或者去分化状态。但也有学者认为，重编程无需达到完全重编程状态，只要可以具有需要的功能即可。例如受体细胞转分化为胰岛B细胞，只要具有胰岛素分泌能力即可，无需完全转分化为胰岛B细胞[27]。

综上所述，在细胞抽提物的重编程过程中，细胞抽提物制备过程简单，可以通过浓缩达到一定有效浓度以保存使用。转入到患者自体的受体细胞内，改变患者自体的受体细胞的表型及功能，使其转变为治疗疾病所需要的细胞，这样获得的细胞可以避免免疫排斥反应，且不会造成大的创伤。重编程技术可以应用于多种细胞，可为组织工程化组织构建提供种子细胞，在组织器官的修复重建领域将具有广阔的应用前景。

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