电针对先天性脑损伤仔鼠脑组织脑源性神经生长因子表达的影响

王风波, 李晓捷, 唐明薇

脑源性神经生长因子(brain-derived neuotrophic factor,BDNF)在中枢神经系统的发育、抵抗伤害性刺激的能力、促使神经元损伤后修复等方面均具有重要的作用,对中枢神经系统疾病及损伤的治疗有着极高的价值和前景。研究显示,BDNF蛋白表达升高的时间与脑损伤的治疗窗相吻合,BDNF阳性表达水平亦随着脑的发育而变化,并与脑损伤有直接的关系[1]。目前已有研究证据显示,电针可上调脑内BDNF的表达水平,促进损伤及坏死灶周围正常神经元轴突芽生,使新的突触形成,并减少神经元凋亡[2]。本实验正是基于上述研究成果和理论依据,采用宫内感染致仔鼠脑损伤模型,用阳性细胞计数方法来观察脑的皮质区BDNF阳性表达情况,进而研究宫内感染对仔鼠的各时期脑组织BDNF阳性表达影响,推测早期电针干预提高神经可塑性和损伤后修复的物质基础及可能机制,为临床治疗提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成熟W istar大鼠60只,雌性40只,雄性20只,体质量≥220 g,由佳木斯大学实验动物中心(合格证号:黑动字D99102001号)提供。

1.2 实验试剂 脂多糖(血清型055∶B5,美国SIGMA公司);羊抗兔BDNF多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色液等(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 脑损伤模型制备 将雌、雄性大鼠室温(21±1)℃下常规饲养,自由饮食,明暗周期各半(12 h/12 h)。环境适应2周后,于17时雌雄比例以2∶1合笼,次日上午8时行阴道涂片检查,查到精子为妊娠第0天,孕鼠另笼饲养。将31只孕鼠按随机数表法分为生理盐水组(n=6)和脂多糖组(n=25)。孕17 d的脂多糖组孕鼠给予脂多糖450μg/(kg·d),连续2 d腹腔注射,生理盐水组孕鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水。孕22 d前分娩的仔鼠为早产鼠,两组均去除早产鼠。仔鼠出生后取胎盘做苏木精-伊红染色观察宫内感染情况,判断标准为大量中性粒细胞浸润。

1.4 分组方法 按随机数表法选取生理盐水组仔鼠32只为对照组,脂多糖组仔鼠56只;脂多糖组仔鼠再按随机数表法分为非干预组32只,电针组24只。

1.5 干预方法 电针组仔鼠7日龄开始进行电针干预,每日1次,干预至28日龄。选取百会、曲池及足三里为干预穴位,参照《实验针灸学》[3]及王琴玉等[4,5]方法,具体操作是:结合人与动物骨度类比,顶骨正中定百会;桡骨近端的关节外侧前方凹陷中取曲池;膝关节后外侧之腓骨小头下约5mm处取足三里。以直径0.2 mm、长20mm的华佗牌针灸针,平刺入百会,进针后觉针下沉紧即可。各穴均连接至电针仪,连续波,频率5～10 H z,强度以头部轻微抖动为度,一般3～5 V,持续10 min。对照组、非干预组仔鼠均常规饲养。

1.6 观察指标 对照组和非干预组仔鼠于24 h各处死8只行脑组织病理学、BDNF表达检测。各组分别于14、21、28日龄行脑组织BDNF表达检测。

1.7 脑组织BDNF检测 采用SABC免疫组织化学染色法,阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗。BDNF阳性细胞判定标准:棕黄色免疫阳性颗粒主要分布在胞浆和细胞膜表面,主干树突和近细胞膜的胞浆处染色较深,而胞体中央细胞核处染色较浅。每例脑组织于皮质区取4张切片,每张切片在显微镜(×400)下随机取4个相互不叠加视野,计数阳性细胞。

1.8 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,计量资料以 x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎盘病理改变及新生仔鼠脑组织病理改变 与对照组仔鼠相比,脂多糖组仔鼠出生后颜色青紫、活动少、肌肉颤动、翻身不能等。脂多糖组孕鼠胎盘病理检测,可见胎盘内血管充血、水肿,大量中性粒细胞浸润;对照组孕鼠胎盘病理检测未见炎症反应。脂多糖组仔鼠脑白质组织疏松,血管扩张,胶质细胞聚集,脑室内出血等;对照组仔鼠脑白质结构完整有序,核仁清楚。

2.2 不同时期3组仔鼠脑组织BDNF阳性细胞检测结果 对照组及非干预组仔鼠1日龄脑组织BDNF阳性反应皆欠均匀,阳性细胞数量少,胞浆着色相对较深,细胞轮廓模糊,突起染色欠佳,胞核无着色;非干预组BDNF阳性细胞计数3.147±0.776,多于对照组1.547±0.653,差异有统计学意义(F=23.48,P<0.01)。随着日龄增加,各组仔鼠BDNF阳性细胞数量均逐渐增多,在21日龄达高峰,细胞轮廓渐清晰,染色增强,部分细胞可见淡染的短突起,28日龄呈下降趋势;非干预组与对照组在各日龄BDNF阳性细胞计数比较差异均无统计学意义(P>0.05);电针组在各日龄BDNF阳性细胞计数均明显高于非干预组与对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组仔鼠不同日龄脑组织BDNF的阳性细胞计数比较( x±s,n=8)

3 讨论

宫内感染是导致新生儿脑损伤的重要致病因素,与脑性瘫痪密切相关。自胚胎18 d至生后25 d是大鼠中枢神经系统发育的关键期,此期内随日龄增加,新生大鼠皮质神经元内的线粒体、粗面内质网和游离核糖体等逐渐增多,脑在结构和功能上具有很强的可塑性。与人类相比,15日龄大鼠的脑发育水平与1周岁儿童相当,28～30日龄大鼠与2周岁儿童相当,而0～2岁是儿童脑发育的关键时期,中枢神经系统逐渐发育成熟。在大脑皮质及海马区分布广泛的BDNF可提高中枢神经系统神经元的存活能力,改善受损神经元的病理状态,促进其再生及分化成熟,因而可防止神经元受损至死亡。在神经元的发育、生长过程中,BDNF具有调节突触传递,促进突触生长和突触重塑等作用,随机体发育成熟其水平逐渐降低,并维持在较低水平。研究发现,新生大鼠脑组织BDNF阳性表达在第20～25天达到高峰,之后呈递减趋势[1]。

本实验结果显示,在发育生长过程中,各组仔鼠脑组织BDNF的阳性反应均越来越强,阳性细胞计数越来越高,在21日龄达到高峰,28日龄呈下降趋势,这与宁晓霞等[6]的研究结果基本一致。与对照组相比,1日龄非干预组BDNF阳性反应较强,差异有统计学意义(P<0.01),此后两组间在各日龄差异均无统计学意义,这与彭洪军等[7]研究结果基本一致。不同日龄电针组仔鼠脑组织BDNF阳性细胞计数均明显高于对照组和非干预组,差异有统计学意义(P<0.01)。1日龄非干预组BDNF阳性反应强于对照组,可能与胎鼠的脑受损时间有关,表明宫内感染所致脑损伤可刺激中枢神经元及星形胶质细胞等合成、分泌BDNF增加,而后对脑损伤仔鼠进行的早期电针干预更明显增强了脑组织BDNF的阳性反应,符合BDNF对中枢神经元的营养、支持和受损后的修复作用。结合本实验仔鼠脑组织苏木精-伊红染色病理检查结果,更说明宫内感染可导致仔鼠脑白质损伤。

宫内感染造成仔鼠脑组织BDNF阳性反应增强可能是通过以下机制:(1)炎症反应激活淋巴细胞、巨噬细胞产生的细胞因子能进一步激活胎盘血管内皮细胞,促使微血栓形成,导致胎盘与胎儿间的血液循环障碍,使胎儿宫内缺血、缺氧、脑内能量代谢降低;(2)使大量细胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+蓄积,致Ca2+超载;(3)透过血脑屏障进入胎儿中枢神经系统的炎症产物激活脑内血管内皮细胞,引起血管栓塞;(4)刺激神经胶质细胞增生,表达细胞因子、一氧化氮、黏附分子等,产生级联反应;(5)促进兴奋性氨基酸释放,以N-甲基门冬氨酸受体蛋白受体作中介,诱导神经元凋亡。这些因素最终都能刺激中枢神经元及星形胶质细胞等合成和分泌BDNF增加。

BDNF对中枢神经系统的保护作用可能是通过提高中枢神经系统对抗代谢性和兴奋性氨基酸毒性损伤的能力,维持细胞内Ca2+的水平,稳定细胞内环境,抵抗一氧化氮介导的谷氨酸细胞毒性,调节自由基代谢,减少自由基在神经元内的积聚。

针灸治疗脑损伤及后遗症历史由来已久,疗效毋庸置疑,对于穴位的选择,中医理论认为:百会穴属督脉,统领一身阳气,与脑关系密切,针灸督脉可补脑益髓;曲池、足三里属阳明经合穴,具醒脑开窍之效,针刺合穴可增强气血运行,促进闭塞经脉疏通,尤其适用于治疗脑损伤致运动障碍。临床实验发现,根据Brodm ann分区,电针曲池穴可以激活同侧初级躯体运动区、辅助运动区、双侧初级躯体感觉区及双侧额上回等中枢区域[8]。故选用针灸督脉百会穴及阳明经合穴作为脑损伤治疗方案,可以振奋周身之阳气,疏经通络,补气益血,提升气血运行,促进肢体功能康复。电针治疗集针刺与电刺激功效于一身,疗效明显优于单纯针刺或电刺激,是现代针灸学最常用之治疗方法。

本实验于第7日龄开始电针干预。实验结果显示,与对照组和非干预组相比,电针组仔鼠脑组织BDNF阳性细胞计数明显增多,差异有统计学意义(P<0.01),说明电针干预可以上调脑损伤动物脑组织BDNF表达水平,促进受损神经的再生与修复。同时,电针组的BDNF阳性表达高峰同样出现在21日龄,28日龄出现下降趋势,与其他组表现趋势一致。电针促使脑损伤后脑组织BDNF阳性反应增强。牛小梅[9]研究分析后认为其可能机制是:保护尼氏体使神经元内蛋白质较正常的合成,促使中枢胆碱能神经系统处于活跃状态,增加内源性保护因子的表达等。本实验虽仅从BDNF角度观察和研究电针对脑损伤的治疗作用,但通过对已研究证实的BDNF生物学效应的分析,进一步证实了电针可通过提高BDNF等神经营养因子水平进而增强脑损伤后的神经修复功能,为临床治疗脑性瘫痪等小儿脑损伤提供了一定的实验依据。

[1] 宁晓霞,师社会,胡海涛,等.脑源性神经营养因子及其受体T rkB在大鼠新皮质的表达研究[J].陕西医学杂志,2007,36(9):1122-1124.

[2] Wang TT,Yuan Y,Kang Y,et al.Effects of acupunctu re on the exp ression of glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)and basic fibroblast grow th factor(FGF-2PbFGF)in the left six th lum bar dorsal root ganglion following removalof ad jacent dorsal root ganglial[J].Neu rosci Lett,2005,382(3):236-241.

[3] 李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社,2003:22-27.

[4] 王琴玉,王文花,靳瑞.针刺对窒息脑瘫幼鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白表达的影响[J].中国康复医学杂志,2005,20(6):423-425.

[5] 王琴玉,孙砚辉,靳瑞.不同时窗针刺对窒息脑瘫幼鼠脑组织b FGF表达的影响[J].中国康复,2005,20(4):195-197.

[6] 宁晓霞,师社会,邢亮,等.BDNF、TrkB在大鼠海马CA 3区的表达及其与学习记忆的关系[J].陕西医学杂志,2008,37(9):1130-1132.

[7] 彭洪军,曹云涛,刘华庆.新生鼠脑缺血预处理后海马CA 1区脑源性神经营养因子的表达和意义[J].贵州医药,2006,30(4):311-314.

[8] 孙忠人,闫立平,谢兵,等.电针曲池、合谷穴脑功能性磁共振成像分析[J].中国中医药科技,2005,12(3):183.

[9] 牛小梅.中医对新生儿缺氧缺血性脑病的认识及治疗研究展望[J].现代中医药,2004,11(3):57-58.