胃癌ZAC基因的杂合性缺失检测

张建勋，朱运良

(郑州大学 基础医学院法医教研室，郑州 450001)

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是人类基因组DNA中广泛存在的一类具有高度多态性和遗传稳定性的遗传标记[1].作为第二代遗传标记已广泛应用于精细遗传图谱的构建、抑癌基因的杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）[2]分析和法医学中的个体识别以及亲权鉴定等多个方面.

本实验利用了已公布的DNA序列信息，首先在6q24区域查找到了位于ZAC基因两侧的4个STR遗传标记，然后用这4个遗传标记对胃癌组织进行LOH分析.研究在胃癌中ZAC基因是否发生了杂合性缺失，并且寻找发生缺失的断裂点的大致位置，为进一步研究LOH的机理及与胃癌的关系打下基础.

1 材料和方法

1.1 试验样本

采用河南省肿瘤医院诊断为胃癌的30例病例为研究对象，取胃癌组织和相对应的正常组织各30例.

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

用有机酚-氯仿法分别提取胃癌组织和正常组织的DNA，并用紫外分光光度计检测其纯度，-20℃保存.

1.2.2 微卫星标记的选择

从GenBank上下载6q24区域的DNA序列，用Tandem Repeats Finder在线软件[3]在这段DNA序列上查找到4个STR基因座，使其分布在ZAC基因两侧.在线软件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）[4]设计引物，引物经过GenBank的BLAST程序检验其特异性.引物由上海生工生物工程技术服务公司合成.4个STR基因座的引物序列、片段长度及位置见表1.

1.2.3 PCR扩增

PCR扩增体系总体积20ul，包括1ng模板DNA，10×Buffer（含Mg2+1.5mmol/L）2μL，10mmol/L dNTPs 0.4μL，100μ mol/L的正反向引物各0.1μL，Taq DNA聚合酶1IU，体积不足部分双蒸水补足.扩增条件采用touch-down反应程序：95℃预变性2min；94℃35s，62℃45s，72℃40s，每一循环退火温度降低0.5℃，共12个循环.然后94℃35s，55℃45s，72℃40s，20个循环.最后72℃5min，12℃保存.

1.2.4 扩增产物的检测及电泳分型

采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染法显示电泳条带.

表1 PCR引物序列、片段长度及物理距离

2 结果与分析

2.1 结果判断

若某一基因座扩增的产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后只有一条条带，则被视为纯合子；若肿瘤的某一等位基因条带与正常样本相比，出现等位基因条带的增多或大小改变，视为微卫星不稳定性（MSI）.出现这两种情况的样本均被视为无信息性的样本,不进行LOH分析.

若某一基因座出现两条大小不同的等位基因条带，定义为杂合子，被认为是具有信息的样本，可用于LOH分析.与正常组织相比较，若肿瘤中某一STR基因座的一条等位基因条带消失或相对密度减少50%以上记为LOH.发生LOH的样本的STR基因座重复实验两次，两次结果一致者被最终判为LOH，发生LOH的样本数与有信息的样本数的比值为LOH频率.

2.2 胃癌ZAC基因杂合性缺失的检测结果

2.2.1 各STR标记的检出率

所选的6q24区域上位于ZAC基因两侧的4个STR标记均有不同程度LOH的发生，其中D6SZ2的缺失率最高，占15.0%.其次为D6SZ1（11.1%），D6SZ3（9.09%），D6SZ4（6.25%）.4个STR标记的LOH缺失频率见表2.

2.2.2 各样本的检出率

30例胃癌样本共检测到了3例发生了LOH，总检测率为10%，这3例样本的LOH图谱见表3.第4和25号样本在D6SZ1，D6SZ2和D6SZ3这三个连续的STR标记中都发生了LOH，D6SZ2和D6SZ3在ZAC基因两侧，说明在4号和25号这两个样本中发生了包含ZAC基因在内的4285651bp的缺失，且在本实验中没有找到两端的断裂点.第28号样本在D6SZ2和D6SZ4处发生了LOH，而D6SZ3处为无信息样本.3个样本的LOH见图1.

表2 30例胃癌6q24上4个STR基因座的LOH频率

表3 杂合性缺失（LOH）图谱

图1 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（T：肿瘤组织，N：正常组织）

3 讨论

ZAC基因定位于人类6号染色体6q24区域[5]，具有调控细胞凋亡和细胞周期阻滞的功能，是一候选抑癌基因.在许多肿瘤细胞中，常检测到基因表达产物下调或缺失，这可能与ZAC基因的LOH、启动子的甲基化和组蛋白的修饰等表观遗传学变化有关[6].

抑癌基因通常通过二次打击机制而失活，即一个等位基因发生了突变，另一个等位基因发生了杂合性缺失.杂合性缺失是在大部分实体瘤的基因组中发现的一种普遍的遗传学改变.非随机区域的杂合性缺失可能意味着在此区域存在有抑癌基因，它的缺失能促进肿瘤的发生和进展，因此它或许有癌变发生、发展的预后征兆的意义.

本实验选取了位于ZAC基因两侧的4个STR标记对胃癌标本做LOH分析，检测了胃癌中的ZAC基因发生了LOH的频率，实验结果表明ZAC基因在胃癌中发生LOH的频率很低，仅为10%，4个STR基因座LOH的检出率也非常低，最高的15.0%，最低的为6.25%.在已发生LOH的3个样本中，都是发生了大片段的缺失，如第4和第25号个体的缺失片段达到4285651bp.本实验证实了在胃癌ZAC基因中发生了低频率的LOH，综合其他文献报道的在其他肿瘤中，ZAC基因经常发生启动子的甲基化和组蛋白的修饰等表观遗传学的改变[6].这提示在胃癌中ZAC基因的LOH和表观遗传学的改变都有可能引起ZAC基因的表达下调或缺失，从而导致了胃癌的发生.

为了进一步研究LOH与肿瘤发生的关系，我们需要进一步研究LOH的机理，找到发生LOH的断裂点，并通过不断增加STR的密度来精细定位断裂点的位置，以至于精细到某几个碱基的位置，并比较发生LOH的这些个体中，它们的断裂点处的碱基序列是否有共同的特征.

[1]任峰玲，郭雄，史晓薇，等.陕西省汉族人群11号染色体10个STR基因座的遗传多态性研究[J].遗传，2007，29（12）：1455-1458.

[2]Starostik P,Greiner A,Schultz A,etal.Genetic aberrations common in gastric high-grade large B-cell lymphoma[J].Blood,2000, 95(4):1180-1187.

[3]Benson G.Tandem repeats finder:a program toanalyze DNA sequence[J].Nucleic AcidsRes,1999,27(2)：573-80.

[4]Steve Rozen,Helen Skaletsky.Primer3 on theWWW for generalusers and for biologist programmers[J].Methods Mol Biol,2000,132: 365-386.

[5]Varrault A,Ciani E,Apiou F,etal.hzac encodes a Zinc finger protein with antiproliferative properties andmaps to a chromosomal region frequently lost in cancer[J].Proc Natl Acad SciUSA,1998,95(6):8835-8840.

[6]Elizabeth M Valleley,Sarah FCordery,David T Bonthron.Tissue-specific imprinting of the ZAC/PLAGL1 tumor suppressor gene results from variable utilization ofmonoallelic and biallelic promoters[J].Human MolecularGenetics,2007,16(8):972-981.