血管内皮生长因子及其受体与Cyclin E-CDK2在肝癌发生发展过程中的表达变化

王 东 李笑岩 李红星 白咸勇

(滨州医学院组织胚胎学教研室,山东烟台264000)

肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤,它的发生发展是一个多因素、多阶段的过程[1]。目前研究表明[2]肿瘤都是血管依赖性的,其中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)与其受体(Vascular endothelial growth factor receptors,VEGFR)对于肿瘤的血管生成尤为重要。VEGF能促进血管内皮细胞分裂、增殖,促进肝细胞增长。而细胞周期的调控主要依赖于由各种细胞周期蛋白(Cyclin)和相应的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)组成的蛋白激酶复合物来完成,其中Cyclin E-CDK2在细胞周期 G1/S期的转折中起着重要作用[3]。目前对VEGF和Cyclin E在肝癌的发生发展过程中的关系的研究比较少,所以我们利用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)建立诱发性肝癌模型[4],模拟人体肝癌发生、发展过程,通过免疫组化、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等实验方法观察VEGF及其受体和Cyclin E及其受体的变化,探讨VEGF和Cyclin E在肝癌发生发展中的关系。

材料和方法

1.材 料

1.1 主要试剂

DEN购自 Sigma公司、兔来源 VEGFR1、Cyclin E、CDK2抗体购自北京博奥森生物技术有限公司、非生物素二步法免疫组织化学检测试剂盒、3-氨丙基三乙氧硅烷(APES)、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 仪器设备

德国莱卡公司的ASP300组织脱水机、EG1160石蜡包埋机和BM2155组织切片机;天津市桐林医疗电子仪器厂的 TP-A展片机;日本奥林巴斯公司的生物显微镜;美国Media Cybernetics的IMA GEPROPLUS图像分析系统;日本Olympus公司的BX31数码显微照相系统;美国BIO-TEIC仪器公司的EL-301型酶联免疫检测仪。

2.方 法

2.1 大鼠肝癌模型的建立及标本收集

雄性 Wistar大鼠(SCXK(鲁)20030008),体重150—200g,共84只,由山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供,饲料由山东省实验动物中心提供。随机分为模型组(72只)和对照组(12只),模型组饲以含DEN的饮水,连续12周;对照组15只常规自由饮水。于实验第 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24周处死动物,随机抽取各时间点的模型组6只和对照组动物1只,麻醉动物,开腹观察肝脏及其他各脏器的大体形态改变及转移情况;迅速剖开胸腔,经心脏穿刺取血5ml,静止0.5h,离心,取血清,置于-80℃保存;取肝脏及肝癌组织置于4%多聚甲醛中固定,常规石蜡包埋,连续切片,厚4μm,用于HE染色和免疫组织化学染色。

2.2 采用ELISA检测血清中VEGF的量

抗大鼠VEGF单克隆抗体包被于酶标板上,除空白孔外,分别将各组大鼠的血清标本(200μl/孔)及不同浓度标准品(100μl/孔)加入相应孔中,用37℃孵箱孵育90min,甩去酶标板内的液体;加入生物素化的抗大鼠VEGF抗体工作液(100μl/孔),37℃孵箱孵育60min,洗板4次;加入辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白与生物素结合物工作液(100μl/孔),37℃孵箱孵育 30min,洗板 5次;加入显色剂90μl/孔,避光37℃孵箱孵育20min;加入终止液100μl/孔,混匀后即刻测量OD450值。

2.3 采用免疫组织化学技术检测 VEGFR1、Cyclin E、CDK2蛋白表达

石蜡切片脱蜡至水,微波热修复,3%H2O210 min阻断内源性过氧化物,山羊血清封闭10min,分别滴加 1:100的兔抗大鼠 VEGFR1、Cyclin E、CDK2抗体4℃孵育18h,抗兔辣根过氧化物酶标记的多聚体,37℃孵育30min,DAB显色10min,PBS终止反应,苏木精复染,脱水,透明,封片。以 PBS代替一抗作为阴性对照。

每只大鼠取2块肝组织进行连续切片,每隔10张切片取1张,连续取5张组织切片进行染色,光镜下观察、摄片,同时每张切片随机取5个视野,利用IMAGE-PROPLUS图像分析系统进行图像分析,测定平均光密度值,每只大鼠计算出一个平均光密度值的平均值。

2.4 统计学处理

数据资料用平均值±标准差(¯x±s)表示,应用SPSS12.0软件进行单因素方差分析,采用LSD法对对照组、肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期、肝细胞癌变期分别进行各组间两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。对血清中的VEGF和VEGFR1、Cyclin E、CDK2在肝组织中表达的平均光密度值进行相关分析。

结 果

1.大 鼠肝脏的病理学改变

对照组大鼠的肝脏表面光滑,色泽鲜艳呈褐色,质地较软。在光镜下观察肝细胞未见异常(图1)。实验组大鼠的肝脏在肝细胞损伤期(第1周至第8周)时,肝细胞水肿、气球样变性逐渐加重,部分肝细胞核固缩甚至消失。肝实质内可见散在坏死灶和炎性细胞浸润(图2)。肝细胞增生-硬化期(第9周至第16周)时,出现大量形态不一、细胞排列不整齐、肝实质内纤维组织增生的假小叶;肝细胞水肿进一步加重,可见不同程度的小泡性脂肪变性。出现嗜酸性和透明细胞增生灶,可见肝细胞增生结节。门管区静脉扩张充血,有不同程度的结缔组织增生,向肝小叶内延伸,伴随胆小管增生(图3)。肝细胞癌变期(第17周至第25周)时,肝组织中可见大小不等的癌结节(图4);肝癌细胞排列呈索状和团块状,可见不同程度的脂肪变性,部分区域有出血、坏死。癌周组织中可见细胞水肿、嗜酸变性、脂肪变性,并有肝细胞增生灶、增生结节及非典型增生结节。

2.血 清VEGF含量

各组大鼠血清中VEGF含量存在差异(F=19.0672,P<0.01),VEGF在对照组血清中含量最低,在肝细胞损伤期、肝细胞增生硬化期、癌变期大鼠血清中逐渐升高,以癌变期的最高(表1)。

表1 利用DEN诱发肝癌过程中大鼠血清中VEGF含量变化Table 1 The change of VEGF in rats serum in the process of liver cancer induced by DEN

3.V EGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白的表达

VEGFR1在正常肝组织中的阳性表达细胞较少(图5);在肝细胞损伤期的大鼠肝脏中的阳性表达主要分布在变性或坏死灶周围的肝细胞(图6);在肝细胞增生-硬化期,阳性表达的肝细胞主要分布在增生间质附近,尤其是血管周围(图7);肝细胞癌变期的肝癌细胞表达阳性,在癌周组织中也可见阳性表达的细胞(图8)。

Cyclin E在细胞质中表达,免疫组织化学染色结果显示为棕黄色,在对照组大鼠肝组织中阳性表达的细胞少(图9);在肝细胞损伤期,阳性表达的细胞在变性坏死组织周围分布较多,并有沿着残余间质分布的趋势(图10);在肝细胞增生-硬化期,阳性表达的细胞呈现出灶状分布的特点,按形成假小叶的特点分布(图11);在肝细胞癌变期,肝癌细胞及胆管上皮细胞上均可见阳性表达(图12)。

CDK2在细胞质和细胞膜上表达,在对照组中,阳性表达的细胞较少见(图13);在肝细胞损伤期时,可见少量阳性表达的细胞,也主要分布于变性坏死灶周围(图14);在肝细胞增生硬化期时,阳性表达的细胞较损伤期时多,阳性表达细胞主要分布于胆管上皮、门管区、肝小叶周边(图15);在肝细胞癌变期时,阳性表达细胞主要位于癌结节、增生结节内(图 16)。

VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表达的平均光密度值均随着肝癌的发生发展有增高的趋势(F值分别为78.8227、19.8682和77.022,P值均小于0.01)(表2)。大鼠血清中的VEGF与肝脏组织中VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表达的平均光密度值随着肝癌的发生发展呈正相关(r=0.834,F=42.1274,P<0.05)。

表2 大鼠肝组织VEGFR1、Cyclin E和CDK2蛋白表达的平均光密度值(¯x±s)Table 2 The mean optic density values of VEGFR1,Cyclin E and CDK2 protein expression in the rat liver tissue(¯x ±s)

讨 论

研究用含DEN的水饲养大鼠以诱发大鼠肝癌模型。肝细胞损伤期肝细胞水肿,部分肝细胞呈嗜酸性变;肝小叶结构尚完整,小叶内可见灶性坏死,伴炎细胞浸润,同时可见纤维组织增生及肝细胞再生。肝细胞增生-硬化期肝细胞水肿进一步加重,表现出不同程度的脂肪变性;可见嗜酸性或透明细胞增生灶、肝细胞增生结节和非典型增生结节;同时肝脏出现不同程度的肝硬化表现。癌变期,12只大鼠表现为肝细胞癌,肝癌细胞呈灶状分布,有2例混合性肝癌;癌周组织细胞水肿、嗜酸性变、脂肪变性,并有肝细胞增生灶、增生结节及非典型增生结节。诱癌过程大鼠肝脏发生的病理学改变与人类肝癌的发病特点和过程接近,故本实验利用此肝癌模型,对肝癌的发生发展机制进行初步的探讨。

VEGF与肿瘤的血管形成关系密切,并与抑制肿瘤细胞的凋亡、促进细胞增殖有关[5]。VEGF在正常组织中呈低水平、稳定表达,而在大多数恶性肿瘤中过表达。本实验观察到,在诱癌的过程中大鼠血清中的VEGF含量逐渐增高,在发生癌变时最高。有研究表明[6],VEGF在肝细胞癌(hepatic cell cancer,HCC)组织、肝细胞及血管内皮细胞均有表达,且癌组织中的表达比癌旁组织高约7倍,表明VEGF在肝癌发展过程中起重要作用[7]。肝癌细胞和肝细胞可以分泌VEGF,而VEGF的生物学功能是通过与其受体VEGFR结合后使受体自身磷酸化而激活细胞内信号传导通路而实现的。本实验观察到肝细胞及肝癌细胞上均有VEGFR1的表达,其表达量和大鼠血清中的VEGF含量呈正相关。提示在肝癌发生发展过程中VEGF和VEGFR1表达均增加,进而促进血管的形成和肝细胞的异常增生。然而导致细胞异常增殖的原因之一,是过度细胞周期蛋白激活和/或抑制蛋白的失活,导致CDKs的过度作用。

Cyclin E是细胞周期蛋白中的一种,它可与CDK2结合形成复合物,磷酸化其底物,释放转录因子 E2F,启动DNA复制,使细胞由 G1期进入S期,是 G1/S期转换的主要限速因子[8]。Cyclin E在正常的组织细胞中为低表达或不表达,但Cyclin E蛋白失去周期性表达,若在整个细胞周期中表达水平高,则可持续地在整个细胞周期中激活CDK2,促使G1/S期转换,使细胞发生异常增殖[9]。本实验结果显示,随着肝癌发生发展Cyclin E和CDK2的表达逐渐增多,提示进入S期的细胞增多,肝细胞表现出异常增殖的特点,发生癌变。同时也观察到Cyclin E及受体 CDK2与VEGFR1的表达量呈正相关。因此我们推测,DEN诱发大鼠肝癌发生发展过程中,肝细胞及肝癌细胞分泌 VEGF增多,VEGF与VEGFR1结合,激活 VEGF信号通路,使 Cyclin E与CDK2结合,启动DNA的复制使细胞进入S期,促使肝细胞异常增生,发生癌变。

[1]董俊峰,吴小鹏.Survivin基因与原发性肝细胞癌关系的研究进展.中国现代普通外科进展,2009,12(4):321-323

[2]Kim J G,Chae YS,Sohn SK,et al.Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms associated with prognosis for patients with colorectal cancer.Clin Cancer Res,2008,14(1):62-66

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[4]李笑岩,白咸勇,刘同慎,等.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的建立及病理学改变.滨州医学院学报,2007,30(6):401-403

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[7]秦将均,柯丽琴,涂蓉.肝癌的VEGF及其受体的研究进展.中国热带医学,2008,8(6):1045-1046

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图 版 说 明

图1-4:HE染色;图5-16:二步法免疫组织化学技术,DAB显色,苏木精复染;标尺=30μm

图1 正常对照组大鼠肝脏(★示门管区);

图2 肝细胞损伤期大鼠肝脏(示嗜酸性变性的肝细胞);

图3 肝细胞增生-硬化期大鼠肝脏(★示增生的胆小管);

图4 癌变期大鼠肝脏(★示肝癌结节)。

图5 VEGFR1在对照组大鼠肝脏中的表达;

图6 VEGFR1在肝细胞损伤期大鼠肝脏的表达;

图7 VEGFR1在肝细胞增生硬化期大鼠肝脏的表达(＊示增生结节);

图8 VEGFR1在癌变期大鼠肝脏的表达;

图9 Cyclin E在对照组大鼠肝脏中的表达;

图10 Cyclin E在肝细胞损伤期大鼠肝脏的表达;

图11 Cyclin E在肝细胞增生硬化期大鼠肝脏的表达(＊示增生结节);

图12 Cyclin E在癌变期大鼠肝脏的表达;图13 CDK2在对照组大鼠肝脏中的表达;

图14 CDK2在肝细胞损伤期大鼠肝脏的表达;

图15 CDK2在肝细胞增生硬化期大鼠肝脏的表达(＊示增生结节);

图16 CDK2在癌变期大鼠肝脏的表达。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig Expression of VEGFR1,Cyclin E and CDK2 proteins in rat livertissue ofDEN-induced hepatocarcinogenesis model

Fig1-Fig4:HE staining;Fig5-Fig16: Immunohistochemical staining,DAB with haematoxyl in counterstain;Scale=30μm.

Fig.1 The rat liver of the control group(★portal area);

Fig.2 Hepatocyte injury period( Eosinophilic degeneration);

Fig.3 Hyperplasia sclerosis period(★hyperplasia of bile ductule);

Fig.4 Cancerous period(★cancerous node);

Fig.5 VEGFR1 expression in the control group;

Fig.6 VEGFR1 expression in the hepatocyte injury period;

Fig.7 VEGFR1 expression in the hyperplasia sclerosis period(＊dysplastic nodule);

Fig.8 VEGFR1 expression in the cancerous period;

Fig.9 Cyclin E expression in the control group;

Fig.10 Cyclin E expression in the hepatocyte injury period;

Fig.11 Cyclin E expression in the hyperplasia sclerosis period(＊dysplastic nodule);

Fig.12 Cyclin E expression in the cancerous period;

Fig.13 CDK2 expression in the control group;

Fig.14 CDK2 expression in the hepatocyte injury period;

Fig.15 CDK2 expression in the hyperplasia sclerosis period(＊dysplastic nodule);

Fig.16 CDK2 expression in the cancerous period.