磁可分固定化漆酶降解甲基橙反应条件的考察

马玉冰，王红霞，徐璐璐

（哈尔滨师范大学 功能材料的设计合成与绿色催化黑龙江省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150025）

目前，随着科技的不断发展，人工合成的染料已达数千种，结构各异[1]。为了满足生产和使用要求，则需要众多染料具有耐光、耐热、抵御生物降解等特性[2]。然而许多染料都具有毒害性，有的甚至会引起癌变，一旦将其引入到环境中，会对人类身体健康，动植物的生长等造成很大的危害[3]。因此，印染废水的净化已成为当今的研究热点之一。

漆酶是一种多铜过氧化酶,利用较强的氧化能力,可以氧化降解酚类、芳香胺类、多环芳烃及对应的衍生物等多种难降解的有机污染物[4-7]，而且漆酶是一种绿色、无毒的生物蛋白酶，在降解过程不会导致二次污染，因此，漆酶在染料废水的治理方面具有重要应用价值。如果把漆酶进行固定化，固定化的漆酶在酶的回收、重复利用和稳定性的改善方面占有很大优势。因此，本文选择具有磁可分性能的固定化漆酶作为催化剂，以甲基橙的降解为探针反应，考察磁可分固定化漆酶对染料的降解性能和重复使用性能。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

乙酸钠（CH3COONa 天津市天达净化材料精细化工厂）；甲基橙（C14H14N3NaO3天津市精细化工开发中心）；冰醋酸（CH3COOH 天津市耀华化学试剂有限责任公司）；2,2′-连氮-双（3-乙基并噻-6- 磺酸）（ABTS，Sigma）；漆酶（Sigma-Aldrich）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，Aldrich）；戊二醛；FeCl2·4H2O（天津市科密欧化学试剂有限公司）；FeCl3·6H2O（天津市福晨化学试剂厂）；正硅酸乙酯（TEOS，Aldrich）；异丙醇、氨水（天津市东丽区天大化学试剂厂）；无水乙醇（天津市凯通化学试剂有限公司）。

UV-2000紫外可见分光光度计。

1.2 实验过程

固定化漆酶的制备：取100mgFe3O4/SiO2分散于50mL乙醇中,超声使其均匀分散，再加入5mL去离子水和0.2mL APTES,在室温下搅拌12h，反应结束后用蒸馏水洗涤、磁分，得到氨基修饰的Fe3O4/SiO2载体，向氨基修饰的Fe3O4/SiO2载体中加入适量浓度的戊二醛，在室温下缓慢搅拌3h，洗涤、磁分，得到的戊二醛活化的载体粒子分散在磷酸缓冲液(pH=5)中备用。取适量的漆酶溶解在pH=7的磷酸缓冲液中，加入到上述溶液中，室温下搅拌一定时间，反应结束后对固定化漆酶洗涤、磁分，最后将固定化漆酶在缓冲液中(pH=5)于4℃保存备用。

固定化漆酶降解甲基橙：取50mg固定化漆酶与5mg·L-1的甲基橙溶液15mL混合，考察温度、pH值和ABTS的添加量、作用时间对漆酶降解甲基橙溶液的影响，通过紫外-可见分光光度计在464nm测定降解后的甲基橙溶液的吸光度确定脱色率。

2 结果与讨论

2.1 pH值的影响

将甲基橙与固定化漆酶的悬浮液置于不同的缓冲溶液(pH值为 3.0～7.0)中，同时加入 750μL ABTS，进行2h脱色反应，考察脱色反应的最适pH值，结果见图1所示。

图1 pH值对甲基橙溶液脱色率的影响Fig.1 The effect of pH value on the degradation of methyl orange solution

从图1中可以看出，除了固定化漆酶对甲基橙的降解作用，磁性载体本身对染料也有一定的吸附作用，在pH值为3和7时，染料的脱色率分别为95.6%和89.1%，当pH值等于3时，固定化漆酶对该染料的降解率达到90.9%，因此，将固定化漆酶降解甲基橙溶液的适宜pH值定为3。

2.2 温度的影响

图2是在pH值为3时，ABTS的量为750μL，不同温度(10～70℃)下，固定化漆酶对甲基橙的降解结果。

图2 温度对PR溶液脱色率的影响Fig.2 The effect of decoloration for degradation of methyl orange at different temperature

从图2中看出，10～30℃之间,固定化漆酶对甲基橙溶液的降解较好，20℃时降解率达到最大，随着反应温度的继续升高，降解率和吸附率快速降低，表明固定化漆酶对甲基橙溶液的降解对温度的依赖性较大。

2.3 介体ABTS的投加量的影响

由于漆酶的氧化还原电势较低，可以通过一些介体的引入提高漆酶的催化氧化能力[8]。图3是在最适温度和pH值条件下，考察ABTS投加量对固定化漆酶降解甲基橙溶液的影响结果。

图3 介体ABTS的投加量对甲基橙溶液脱色率的影响Fig.3 The effect of the amount of ABTS on decoloration of methyl orange solution

图3结果表明，在未引入介体ABTS的条件下，甲基橙溶液脱色率几乎为0，而随着介体ABTS的引入，明显发现该介体甲基橙溶液的降解有促进作用，而且随着ABTS投加量的增加，脱色率逐渐提高，当加入750μL ABTS时，脱色率达到95.6%，反应时间为120min。

2.4 反应时间对降解效果的影响

图4是在pH值为3时，温度在20℃下，加入750μL ABTS测得的甲基橙的降解结果。

图4 作用时间对甲基橙溶液降解效果的影响Fig.4 The effect of reaction time on decoloration of methyl orange solution

从图4中看出,随着作用时间的不断增加，甲基橙溶液的脱色率明显呈上升趋势，在120min时甲基橙的脱色率达到95.6%，随着反应时间的继续升高，甲基橙溶液的脱色率已不再增加，表明120min后，固定化漆酶对甲基橙溶液的降解比较充分。

2.5 固定化漆酶磁响应行为及操作稳定性

利用外磁场对固定化漆酶进行回收，考察了固定化漆酶降解甲基橙溶液的循环使用性能，结果见图5。

图5（a）显示了利用外磁场可将固定化漆酶与反应液有效分离，说明固定化漆酶具有良好的磁可分性能；图5（b）是固定化漆酶降解甲基橙溶液的10次反应结果。图5（b）显示，在连续使用该催化剂的过程中，甲基橙溶液的脱色率有下降的趋势，但是催化剂使用10次以后甲基橙溶液的脱色率仍保持在70%以上，由此说明该磁可分的固定化漆酶具有较好的操作稳定性，适于重复使用。

图5 固定化漆酶降解甲基橙溶液Fig.5 Immobilized laccase degradated methyl orange solution

3 结论

本文采用Fe3O4/SiO2为载体固载的漆酶进行甲基橙溶液的降解研究，对理想的降解条件和漆酶的稳定性进行了考察。结果表明：（1）添加介体ABTS后，可以有效促进固定化漆酶对甲基橙溶液的降解，当甲基橙初始溶液的pH值为3、反应温度20℃、加入750μL介体ABTS、作用时间为120min时可以实现固定化漆酶对甲基橙溶液的有效降解，脱色率在95%以上；（2）以Fe3O4/SiO2为载体固载的漆酶可以利用外磁场进行分离，在连续使用10次以后，甲基橙的脱色率仍能达到70%以上，说明该催化剂具有很好的磁可分性能和较稳定的降解性能，在降解染料方面展现了广阔的应用前景。

［1］吴国宾.国内外活性染料的现状和发展趋势［J］.江苏化工，1999,27（1）:12-14.

［2］李强.新型固定化漆酶复合载体的合成及降解染料的研究［D］.南京林业大学硕士论文，2006.

［3］朱启忠,吕新萍,徐国英，等.漆酶对染料的脱色研究［J］.资源开发与市场，2009,25（6）:484-486.

［4］Patricio Peralta Zamora,Cláudia M.Pereira,Elaine R.L.Tiburtius,et al.［J］.2003,42（2）:131-144.

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［7］S.Ryan,W.Schnitzhofer,T.Tzanov,A.Cavaco-Paulo,G.M.Gübitz.［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003,33:766.

［8］R.Bourbonnais,M.G.Paice,B.Freiermuth,E.Bodie,S.Borneman.［J］.Appl Environ.Microbiol，1997,63:4627.