辛伐他汀对实验性兔动脉粥样硬化进程中HO/CO系统的影响

于清霞,戴 琳,王 辉,周少玲

(1.山东省烟台毓璜顶医院,山东烟台,264000;2.山东省烟台市烟台山医院,山东烟台,264001)

一氧化碳(CO)作为新近发现的气体信号分子,已有研究证实[1],在动脉粥样硬化(AS)进程中具有重要作用,通过舒张血管、抑制单核细胞及血小板向内皮的黏附聚集、抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移等方面的作用来抑制动脉粥样硬化进程。血红素加氧酶(HO)是内源性一氧化碳的限速酶和关键酶[2],以血红素为底物降解生成胆红素、铁及CO。HO有3种同工异构酶即HO-1、HO-2及HO-3。他汀类的抗动脉粥样硬化作用已有肯定的报道,但具体机制尚需进一步研究。CO作为新近发现的动脉粥样硬化进程中重要介质,而他汀类对HO/CO系统的影响,国内外尚无报道。本文通过动物试验观察了食饵性家兔主动脉HO-1的表达及CO生成量的变化以及辛伐他汀对HO/CO系统的影响。

1 材料与方法

1.1 AS模型的复制及动物实验分组

24只新西兰雄性大白兔(购自山东省农科院),饲以120～140 g普通饲料添加1%胆固醇粉1 g/d(湖南华富制药有限公司),于傍晚给药。24只大白兔以胆固醇膳食8周后,随机分为3组,每组8只。模型组用普通饲料;辛伐他汀组(由浙江新昌京新制药有限公司提供),10 mg/d。每组继续给予普通饲料120～140 g,喂养8周。对照组(普通喂食对照组):8只新西兰大白兔,给予普通饲料120～140 g喂养16周。

1.2 各项生化指标的测定

于实验开始、8周末、16周末,禁食12 h以上,经耳缘静脉抽血备用。

1.2.1 血脂测量过程及方法:采用沉淀漂浮酶联法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.2.2 内源性CO含量的测定:应用Chalmers AH[3]的方法,根据CO与血红蛋白亲和力较氧强210倍,让样品中CO与血红蛋白溶液相互作用,生成血红蛋白一氧化碳复合物,再以连二亚硫酸盐还原检测CO复合物的含量。

1.3 主动脉光镜标本制作

16周末,麻醉动物后迅速开胸,暴露心脏,采用冰生理盐水(4℃)充分灌洗心脏,分离整个主动脉,于主动脉弓下缘水平切取主动脉长约1～2 cm,剥除外膜结缔组织,部分组织置入10%中性缓冲甲醛液中固定,常规石蜡切片,HE染色。

1.4 主动脉 α-actin 、CD68、HO-1 的表达

采用免疫组织化学方法进行染色。兔抗人HO-1多克隆抗体试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,兔抗人α-actin单克隆抗体、兔抗人CD68单克隆抗体均由北京中山生物工程有限公司提供。采用武汉同济医科大学清平公司软件MPI-500多媒体彩色病理图文分析系统对HO-的表达进行定量分析。

2 结 果

2.1 血脂检测结果

与对照组相比较,模型组除HDL外血脂水平明显升高(P<0.01),用药后辛伐他汀组血浆TC、TG、LDL下降明显(P<0.01),HDL升高(P<0.01)。用药后氨氯地平组血浆TC、TG、LDL与模型组比较无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 血浆一氧化碳测定结果

与对照组相比较,血浆一氧化碳水平明显升高(P<0.01),用氨氯地平进行干预后血浆一氧化碳水平明显降低(P<0.01),见表1。

表1 各组总胆固醇、甘油三酯、和高密度、低密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)及血浆一氧化碳含量(mg/L)的测定结果(±s,n=8)

表1 各组总胆固醇、甘油三酯、和高密度、低密度脂蛋白胆固醇(mmol/L)及血浆一氧化碳含量(mg/L)的测定结果(±s,n=8)

与模型组比较,＊＊P<0.01。

组别 时间(周) TC TG HDLC LDLC CO对照组 0 1.27±0.45 0.76±0.27 0.44±0.17 0.74±0.23 0.142±0.084 8 1.33±0.55 0.86±0.33 0.45±0.19 0.88±0.14 0.135±0.149＊＊16 1.28±0.43 0.85±0.44 0.50±0.13 0.95±0.25 0.133±0.152＊＊模型组 0 1.33±0.52 0.73±0.21 0.43±0.17 0.79±0.21 0.134±0.071 8 12.15±4.37 1.38±0.58 0.38±0.21 11.32±6.01 0.505±0.030 16 11.74±3.11 1.28±0.36 0.44±0.21 9.34±2.88 0.490±0.250辛伐他汀组 0 1.29±0.50 0.78±0.28 0.44±0.18 0.73±0.22 0.147±0.096 8 11.36±3.75 1.06±0.30 0.45±0.20 8.98±3.11 0.517±0.126 16 4.41±3.88＊ 0.52±0.28＊＊ 0.63±0.12＊＊ 3.01±3.32＊＊ 0.157±0.077＊＊

2.3 大体病理学观察

16周正常对照组兔主动脉内膜光滑,无脂质沉积。动脉粥样硬化模型组,可见动脉内膜面有浅黄色斑块状突起,散在或融合成片,多分布于血管分叉周围,其长轴多与主动脉长轴平行,以主动脉弓部病变最重。16周末药物治疗组斑块突起较动脉粥样硬化组减少,以辛伐他汀组最为显著。

2.4 免疫组织化学检测结果

HO-1的阳性染色主要位于内膜的内皮细胞胞质内及中膜的平滑肌细胞胞质内,染色成棕色颗粒状或条状。在正常对照组主动脉内皮细胞内呈扭曲线条状阳性反应,在平滑肌细胞内呈阴性反应。在模型组主动脉内膜及内膜下有强阳性反应带,中膜平滑肌内见灶片状强阳性。药物干预组主动脉内皮细胞内可见阳性反应颗粒,而中膜平滑肌内呈弱阳性或阴性(图1)。

图1 免疫组织化学检测主动脉内血红素氧合酶1的表达 400倍

2.5 主动脉HO-1表达的定量检测

采用图像分析仪定量检测,主动脉HO-1表达值对照组为8.82±0.36,模型组为17.55±1.19,辛伐他汀组为14.48±0.49,氨氯地平组为12.20±0.48。模型组表达明显高于其他各组(P<0.01),辛伐他汀组血红素加氧酶-1表达值为14.48±0.49与模型组比较有显著差异(P<0.05)。

3 讨 论

CO作为新近发现的气体信使分子在生物体内的作用方式与NO相似,都可以激活sGC,升高细胞内CGMP而发挥作用;在神经系统中作为神经递质,在其他系统中作为细胞信使分子发挥作用[4],从而成为心血管系统的重要血管活性物质。可通过以下机制参与动脉粥样硬化进程:①能激活鸟苷酸环化酶(GC),增加细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平,进而产生舒张血管和抑制血小板聚集等作用;还可以通过激活Ca2+依赖型K通道通过Ca2+脱敏导致血管扩张。②可通过抑制成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化;抑制细胞周期调节蛋白A激酶和周期素依赖性蛋白激酶2的活性间接或直接作用于细胞周期,从而对抗血管损伤导致的内膜过度增生。CO还可通过旁分泌的方式抑制内皮素1和PDGF-B基因mRNA的表达,减少内皮源性丝裂原的表达,抑制血管平滑肌细胞的增殖。③可以增加抗炎细胞因子白细胞介素10的表达,而减少促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子1β的表达。并通过减少细胞间黏附因子的产生,减少单核/巨噬细胞在血管壁的聚集,表现出明显的抗炎作用[5-8]。

近年来,他汀类药物作用的多效性引起了人们的极大关注,其中,他汀类药物的抗炎作用倍受人们的关注,它与临床试验中发现的他汀类药物降低心血管事件发生的早期效益有关[9-10]。而辛伐他汀作为临床上最常用的他汀类药物,许多研究发现它既可降低血脂,亦对As的炎性成分也有直接或者间接的影响[11-13]。本实验经药物干预8周后,与模型组比辛伐他汀组血脂水平明显下降。干预16周后血浆CO水平明显下降,用药前后有显著性差异(P<0.05)。药物干预后免疫组织化学检查示兔胸主动脉HO-1表达明显减弱,表达程度的定量分析显示用药前后有显著性差异(P<0.05)。CD68及α-actin的阳性染色明显减弱,其代表粥样硬化斑块内主要细胞成分即巨噬细胞及平滑肌细胞的多少,二者表达减弱提示动脉粥样硬化斑块的消退。大体病理示动脉粥样斑块较模型组明显减少。上述结果表明在动脉粥样硬化进程中,HO/CO系统呈代偿性上调趋势,而经辛伐他汀干预后,动脉粥样硬化斑块可部分消退,同时HO/CO系统的代偿作用亦减弱。辛伐他汀可能通过改善血管内皮功能、降低血脂水平减少动脉粥样硬化进程中的促发因素如各种炎性因子、氧自由基等,从而下调起代偿作用HO-1的表达,而部分抑制动脉粥样硬化的进程。从而进一步丰富了他汀类药物抗动脉粥样硬化的机制。

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