慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+调节性T细胞及部分细胞因子的变化

王小凤,彭雁忠,童新灯,汤炽良,陈丽嘉,武 敬,王凤卿,黄清清

(北京大学深圳医院感染性疾病科,广东深圳,518036)

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒感染而引起的 肝脏慢性炎症。目前,世界上约有3.5亿HBV携带者,其中每年15%～40%发展为肝硬化、肝细胞癌,给人类健康带来极大的危害。作为全球感染率最高的国家,中国有1.3亿HBV携带者,约2.3千万CHB患者[1]。据报道,CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)和Th1/Th2的失衡均可导致乙型肝炎慢性化[2-3]。本文就 CHB患者 CD4+CD25+Treg及部分细胞因子的变化进行研究,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年10月～2009年9月期间北京大学深圳医院感染性疾病科收治的临床确诊CHB患者 24例[男20例,女4例,年龄(35.92±1.52)岁]作为CHB组,AHB患者8例[男4例,女4例,年龄(35.50±3.05)岁]作为AHB 组,健康体检者12例[男6例,女6例,年龄(25.33±0.26)岁]作为对照组。诊断符合2005年中华医学会肝病学分会制定《慢性乙型肝炎防治指南》[4]的标准,并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等。所有操作程序均符合伦理协会制定的伦理学标准,且所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

CD4-FITC、CD25-PE、IgG1-FITC、IgG2a-PE和 Optlyse c溶血液,购自美国 BECKMAN COULTER公司。Epics XL型流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞;AU5400生化分析仪检测肝功能,试剂由日本奥林巴斯公司提供;荧光定量RT-PCR法检测血清HBV-DNA,试剂盒由达安公司提供。ELISA双抗体夹心法测定血清中 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的含量,试剂盒由武汉博士德公司提供。

1.3 方法

流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞百分率:①采集所有研究对象的新鲜外周血(EDTA-K2抗凝),设同型对照和检测管。②检测管中加入抗人CD4-FITC/CD25-PE单克隆荧光标记的抗体各20 μ L,同型对照管中加入IgG1-FITC/IgG2a-PE单克隆荧光标记的抗体各20 μ L。③分别加入100 μ L新鲜抗凝全血,混匀,室温下避光放置15 min。④加入 500 μ L Optlyse c溶血液,混匀,室温下避光放置10 min。⑤加入500 μ L PBS,室温下避光放置 10 min,1 500 r/min离心5 min后弃上清。再用2 mL PBS洗涤,1 500 r/min 5 min后弃上清。最后加入500 μ L PBS悬浮细胞,24 h内检测。用标准微球进行光路和流路的校正,利用同型对照管调整电压,上机计数5 000个淋巴细胞,使用XL2软件收获检测管细胞数据并进行分析。

AU5400生化分析仪进行肝功能检测,荧光定量RT-PCR法检测血清HBV-DNA,ELISA双抗体夹心法检测细胞因子。所有操作均严格依照说明书进行。

2 结 果

2.1 各组一般资料(表1)

表1 一般资料(±s)

表1 一般资料(±s)

组别 例数 年龄 ALT(U/L)HBV-DNA(copies/L)CHB组 24 35.92±1.52492.15±83.49(5.9±1.4)×107 AHB组 8 35.50±3.05612.24±116.13(1.5±1.0)×107对照组 12 25.33±0.26 24.33±2.05 -

2.2 各组CD4+CD25+Treg百分率

单因素方差分析显示,CHB组CD4+CD25+Treg百分率均明显高于AHB组和正常对照组(P<0.01)。AHB组与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组外周血CD4+CD25+Treg百分率(±s)

表2 各组外周血CD4+CD25+Treg百分率(±s)

与CHB组比较,＊＊P<0.01。

组别 例数 CD4+CD25+Treg百分率CHB组 24 14.93±0.60 AHB组 8 8.64±0.75＊＊对照组 12 9.06±0.35＊＊

2.3 CD4+CD25+Treg与HBV-DNA、血清ALT的相关性

通过pearson相关系数检验发现CHB组和AHB组CD4+CD25+Treg与HBV-DNA之间无明显相关性(r=0.232,P=0.276;r=0.34,P=0.409);CHB组和AHB组CD4+CD25+Treg与ALT之间无明显相关性(r=0.196,P=0.357;r=-0.368,P=0.369)。

2.4 细胞因子的测定

所有检测结果单位为pg/mL。CHB组IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及 TGF-β水平较正常对照组明显升高(P<0.01),差异有统计学意义。见表3。

表3 CHB组和正常对照组IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的水平(±s,pg/mL)

表3 CHB组和正常对照组IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的水平(±s,pg/mL)

与对照组比较,＊＊P<0.01。

组别 例数 IL-2 IL-4 IL-10 IFN-γ TGF-β CHB组 24 31.27±3.16＊＊ 52.12±2.65＊＊ 165.78±11.33＊＊ 76.25±1.70＊＊ 10.96±0.83＊＊对照组 12 14.68±1.77 25.06±2.66 84.49±3.21 43.00±2.92 5.73±0.64

2.5 IL-2、IFN-γ与血清ALT的相关性

CHB组IL-2、IFN-γ与血清ALT的相关性:通过pearson相关系数检验发现,CHB组IL-2和IFN-γ分别与血清ALT水平正相关(r=0.442,P=0.030;r=0.469,P=0.021)。

3 讨 论

CD4+CD25+Treg为免疫系统中一类起负性调节功能的细胞,约占外周血CD4+T细胞的5%～10%,由 Sakaguchi等[5]在1995年首次报道。它涉及临床多个领域,包括抑制自身免疫性疾病、移植物抗宿主病,诱导母胎免疫耐受,导致肿瘤、感染性疾病的发生、发展,其主要分子标志物有Foxp3、GITR、CTLA-4等。体内试验表明,CD4+CD25+T reg可分泌 IL-10和 TGF-β,全面抑制CD4+及CD8+T细胞的活化[6-7]。目前多数观点认为CD4+CD25+Treg可抑制HBV抗原特异性T细胞反应,与CHB的慢性化有关。CD4+CD25+Treg在AHB中随病程发展而变化,具体表现为,初始期降低,恢复期上升,痊愈后恢复正常水平,推测与不同病程阶段CD4+CD25+Treg的功能不同有关[3]。

T淋巴细胞主要介导细胞免疫,根据功能的不同,可分为辅助性T细胞(helper T cells,Th)、细胞毒性T细胞和调节性T细胞。其中,Th分为Th1、Th2、Th3三种亚型。Th1主要分泌 IFN-γ、IL-2、TNF 等细胞因子,主要促进细胞免疫,但反应过度将会引起组织损伤,亦称为促炎性T细胞。Th2主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等细胞因子,可增强B细胞介导的体液免疫。Th3分泌大量TGF-β,对免疫应答发挥负性调节作用。通常,以IFN-γ和IL-4反映体内Th1和Th2水平。Th1/Th2之间的平衡,维持机体正常的免疫状态。

Akpolat N等[8]检测30例CHB患者血清中TNF-α、IL-4、IFN-γ、TGF-β含量 ,对肝组织进行活检后发现,TNF-α、IL-4和 TGF-β水平明显高于健康对照组,认为 IL-4、TGF-β均与CHB的病情进展有关。Jiang R等[9]采用荧光激活细胞分类仪分析CHB和正常对照者的PBMCs中IL-4、TGF-β、IFN-γ的表达,发现 CHB 患者 PBMCs中大部分CD4+T细胞为Th0,在肝炎活动期,Th1明显增多,而Th2变化不大。他们认为,Th1与肝脏炎症正相关,Th2与HBV持续感染有关。Lee M等[10]采用RT-PCR法检测CHB患者和正常对照者 PBMCs的 IL-2、IL-4、IL-10和 IFN-γ的表达,发现IFN-γ与ALT水平呈正相关。以上说明,感染HBV后,体内 Th1/Th2出现失衡,表现为免疫损伤或HBV免疫逃避,Th1占优势,表现为CHB的急性期,Th2占优势,表现为CHB持续状态。

本试验共选取慢性乙型肝炎患者24例,急性乙型肝炎患者8例,正常对照者12例。慢性乙型肝炎组CD4+CD25+Treg百分率均明显高于正常对照组和急性乙型肝炎组,而急性乙型肝炎组与正常对照组之间差异无统计学意义,与田瑛等[11]在2007年的一项研究结果一致。另外,本试验发现,慢性乙型肝炎组和急性乙型肝炎组 CD4+CD25+T reg百分率与HBV-DNA含量无明显相关性,提示乙型肝炎病毒并非疾病慢性化的主要原因。关于CD4+CD25+T reg与ALT之间的关系,Lin CY等认为肝脏的损伤可增强慢乙肝患者Treg的抑制活性,他们在体外试验中发现,外周血Treg百分率与血清ALT水平成正比,去除Treg后,血清 ALT较高的患者 HBV特异性CD8+T细胞的增殖反应明显高于血清ALT较低的患者[12]。但国内外大量研究都指出,外周血CD4+CD25+Tregs频率与血清ALT水平无相关性[1,13]。本试验也未发现外周血CD4+CD25+Tregs频率与血清ALT之间存在相关性。

同时,本试验分析了24例慢性乙型肝炎患者和12例正常对照者的血清,分别检测IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及 TGF-β的水平。结果表明,CHB 组血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及TGF-β水平均高于正常对照组,结果有统计学意义。IL-10和TGF-β作为CD4+CD25+Treg分泌的细胞因子,其升高提示,CD4+CD25+Treg作为抑制性免疫细胞,通过分泌IL-10和 TGF-β,下调免疫功能,抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化,阻碍HBV的清除,导致乙肝病毒肝炎慢性化的发生和发展。Th3、Th2和 Tr1也分泌 IL-10和TGF-β,IL-10和 TGF-β的升高,一定程度上反映Th3、Th2、T r1活跃。IL-4作为 Th2的主要效应因子,提示Th2占优势,机体以体液免疫为主,细胞免疫功能受到抑制,出现Th1/Th2的失衡。而IL-2及IFN-γ作为炎症因子,其水平亦较对照组升高,同时,本实验比较了CHB组IL-2、IFN-γ分别与血清ALT的相关性,发现IL-2和IFN-γ分别与血清ALT水平正相关(r=0.442,P<0.05;r=0.469,P<0.05),与Priimiagi LS等[14]报道相符。说明Th1可诱发肝脏炎症活动,同时,体内Th2细胞因子能拮抗Th1细胞因子的作用,减轻肝脏炎症反应,维持HBV慢性化感染。

慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+Treg百分率和Th1、Th2细胞因子均明显高于正常对照者,提示慢性乙型肝炎患者存在免疫紊乱,CD4+CD25+Treg和 Th1/Th2失衡均与其慢性化有关。但是,CD4+CD25+Treg和Th1/Th2失衡在HBV感染慢性化过程中的具体机制仍未完全明确,本研究亦未对CHB患者抗病毒治疗前后的CD4+CD25+Treg百分率和Th1、Th2细胞因子水平进行分析,有待进一步研究,为慢性乙型肝炎的临床免疫治疗提供更多的依据。

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