AutoPBSC程序与MNC程序采集外周血造血干细胞的比较研究

王 钧,孟庆祥,刘金玲,范爱飞,周 宇,聂李平,孙丽华,张文丽,张红宇,姚志娟,郭乃榄

(北京大学深圳医院血液科,广东深圳,518036)

健康供者的外周血造血干细胞(PBSC)采集是异基因外周血造血干细胞移植成败的关键步骤。一方面PBSC的数量及质量与移植后能否重建造血功能、急慢性移植物抗宿主病的发生、疾病的复发等有密切关系;另一方面,临床上希望找到更有效的采集程序,减少采集并发症,减轻供者痛苦,降低采集费用。COBE Spectra血细胞分离机是目前国内外常用的连续性细胞分离装置,近年来在半自动采集程序(MNC程序)基础上,又开发出了自动采集程序(AutoPBSC程序)。目前国内关于AutoPBSC程序的报告尚不多见,本科2002年3月～2008年3月期间对应用该分离机的两种采集程序对健康供血者的PBSC进行采集并进行比较,现将结果报告如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料

2002年3月～2008年3月期间,本院健康供者53例,年龄 15～56岁,中位年龄31岁,男 30例,女23例。同胞供者51例,其中HLA位点全相合37例,HLA位点不全相合14例;无关供者2例。供者中合并高血压2例,糖尿病1例,地中海贫血基因携带者1例。

1.2 供者采集前动员

健康供者采用重组人类粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF,格拉诺赛特 5 ～ 10 μ g/(kg·d)皮下注射,第4天开始采集PBSC。采集PBSC的阈值为MNC>(6～8)×108/kg,CD34+细胞>2×106/kg,CFU-GM>1×105/kg)。

1.3 PBSC采集方法

使用美国COBE Spectra血细胞分离机,随机采用AutoPBSC与MNC 2个不同程序采集PBSC,其中采用AutoPBSC程序63例次,MNC程序50例次。MNC程序需操作人员根据经验,通过目测比色法手控调节血浆泵流速进行造血干细胞采集,每次采集平均循环3个血容量;AutoPBSC程序为采集系统通过浓度比浊法自动监视,每循环1 200～1 600 mL,以采集+回冲(各4 mL)方式定量收集PBSC 8 mL,避免人为改变采集过程,每次采集循环3个血容量,采集约50～80 mL PBSC。

1.4 PBSC检测指标及方法

CD34+细胞:应用流式细胞仪检测;CFU-GM检测按常规方法应用CO2培养箱中培养,10 d及14 d在倒置显微镜下分别计数培养细胞集落(≥40个细胞为一集落);单个核细胞测定应用Sysmax SE-9500血细胞分析仪,结合人工涂片分类计数。供者血红蛋白、白细胞及血小板:应用Sysmax SE-9500血细胞分析仪,血常规监测时间为采集当日和次日。

1.5 PBSC的输注及冻存

2种程序采集的外周血造血干细胞均不需特殊处理可直接由患者中心静脉插管输注。如供、患者间血型相合或仅次要不合则患者不需特殊治疗;供、患者血型完全不相合则患者在输注PBSC前需补液扩容(2 500 mL/m2),并加用5%碳酸氢钠125 mL碱化尿液及速尿20 mg利尿处理。

冻存处理:将PBSC悬液终浓度调至小于2×107/mL,与含有6%羟乙基淀粉(6%HES,贺斯)及终浓度5%的二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保存液混合后直接置入-80℃超低温冰箱内保存。

2 结 果

2.1 2种程序采集PBSC指标的比较

53例健康供者共采集PBSC 113例次,其中采用AutoPBSC程序63例次,MNC程序50例次,平均每例供者采集PBSC 1～4次,中位采集次数为2次。AutoPBSC程序与MNC程序比较,外周血造血干细胞的体积小,采集袋中血小板及红细胞混入量少,单个核细胞、CD34+细胞百分数和总数较高。但统计学处理发现,2种方法采集的单个核细胞总数差异无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 2种程序采集PBSC指标的比较(±s)

表1 2种程序采集PBSC指标的比较(±s)

与MNC程序比较,＊＊P<0.01。

项目 AutoPBSC程序 MNC程序混血小板数(×109) 45.56±13.28＊＊ 21.22±8.32 PBSC体积(mL) 77.23±14.1＊＊ 241.44±28.79 MNC(%) 95.56±2.62＊＊ 82.27±8.31 MNC(×109) 15.32±3.61 14.44±5.41 CD34(%) 3.1±1.42＊＊ 1.97±0.89 CD34(×106) 23.76±7.34＊＊ 1.97±0.89混入红细胞数(×109)33.3±18.62＊＊ 113.12±45.5

2.2 采集对供者血常规的影响

AutoPBSC与MNC 2种程序采集PBSC后供者血红蛋白含量变化无显著性差异,血小板计数在应用 MNC程序组呈显著性下降,提示应用MNC程序更易损失血小板;而AutoPBSC程序组则血小板损失较少(表2)。

表2 两种程序采集PBSC后供者血常规变化(±s)

表2 两种程序采集PBSC后供者血常规变化(±s)

与MNC程序比较,＊＊P<0.01。

程序 血红蛋白下降(g/L)血小板计数下降(×109/L)AutoPBSC 1.08±0.36 24.3±12.67＊＊MNC 1.74±0.10 65.21±23.76

2.3 特殊情况

1例地中海贫血(基因携带者)供者首日应用AutoPBSC程序采集 PBSC后,发现 MNC及CD34+结果明显低于AutoPBSC程序采集中位水平,红细胞数目明显高于中位水平且有核红细胞。第2、3天换用MNC程序,获得足够采集结果。

2.4 植活情况

所有异基因外周血造血干细胞移植均顺利植活,中性粒细胞大于0.5×109/L,中位时间14 d(11～22 d),血小板计数大于20×109/L,中位时间为13 d(9～26 d),HLA位点全相合与不全相合异基因造血干细胞移植中性粒细胞植活时间比较无统计学差异。

3 讨 论

近年来,国内异基因外周血造血干细胞移植的临床应用迅速发展。作为外周血造血干细胞移植的重要环节,外周血造血干细胞采集的数量、质量与移植结果密切相关[1]。与采集供者骨髓相比,外周血造血干细胞采集更方便,可反复采集得到大量造血干细胞,且移植后造血恢复更快,供者不需麻醉痛苦较小,安全性提高,易于被供受者双方接受[2-6]。

目前临床应用的血细胞分离机是根据梯度离心原理,利用不同血液成分的密度差异,将血液成分在一次性无菌分离管路中进行分离、采集和收集。与其他血细胞分离装置如CS3000 Plus(Baxter)、MCS 3P(Haemonetics)比较,COBE Spectra具有同样时间内分离血流量大、CD34+细胞产率高的特点;其造血干细胞分离物是保存在离心仓外的产品袋中,避免了长时间受到离心力的破坏和离心仓温度因素对采集物的潜在危险;且明显降低了采集物中红细胞、血小板数量和采集容积[7]。另外,Ford等[8-9]研究发现,与CS3000分离机相比,COBE采集结果对需要输入装置的细胞参数(红细胞压积及白细胞计数等)依赖性小,采集性能更趋稳定。

COBE Spectra分离机的AutoPBSC程序是全自动化分离程序,与传统MNC程序比较,具有更多优势:体外循环血量少(165 mL对比284 mL),利于在儿童及低体质量人群的采集;采集物体积小,利于进行细胞处理及细胞冻存;采集物含中性粒细胞及血小板量少,减少对干细胞污染等[10-11]。Heuft等对88例患者102次采集结果分析表明,应用AutoPBSC程序分离一次即达到移植阈的比例为85%[12],显示具有较高的采集效率。对于干细胞采集的数量及效率则有不同的报道,Rowley等研究比较供/患者应用2种程序分离PBSC的结果,终移植阈为CD34+细胞大于5×106/kg,结果分析表明与Auto PBSC程序相比,MNC程序的分离效率更高[13]。

本研究显示与MNC程序比较,AutoPBSC程序有以下特点:①单个核细胞和CD34+细胞百分比提高,但综合计算二者分离物中单个核细胞总数及CD34+细胞总数是相近的,提示两种分离方法均可有效采集到足够的造血干细胞;②采集物中含血小板数下降,对供者血小板影响小,对于顺利进行下一次分离尤为重要;③采集物体积减少,利于造血干细胞冻存。本组供者113例次采集中,发现1例次携带地中海贫血基因供者应用AutoPBSC程序失败的情况,分析可能与供者年轻红细胞较多且存在有核红细胞有关,二者密度接近于单个核细胞。AutoPBSC程序限定每循环仅采集3～5mLPBSC,每次采集时红细胞混有过多,导致单个核细胞无法有效采集到有关。该供者换用MNC程序后顺利采集到足够PBSC,表明不是供者干细胞动员的原因。

本研究认为,AutoPBSC程序在外周血造血干细胞分离采集领域有独特优势,尤其适用于首日采集、低体质量儿童、分离时血小板低下(特别采集是第2天)、分离后须进行冷冻或需要进行CD34+细胞分选等情况。但携带地中海贫血基因或轻型地贫供者应慎用AutoPBSC程序。

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