COX-2在人肝细胞癌中的表达及其对耐药性的影响

何友钊,李 波,刘 勇,苏 松,袁 庆,陈 川,张孟瑜,刘长安,龚建平

(1.江苏省无锡市第三人民医院肝胆外科,江苏无锡,214041;2.四川泸州医学院附属医院肝胆外科,四川泸州,646000;3.重庆医科大学附属第二医院肝胆外科,重庆,400010)

肝细胞肝癌(HCC)对多种化疗药物具有耐药性在临床较为常见,其主要原因之一是HCC细胞中存在多药耐药基因(mdr1)及其产物P-糖蛋白(P-gp)和其他耐药基因及其蛋白表达的过度表达。诱导型环氧合酶-2(COX-2)与肿瘤的关系早已被人们关注,研究发现COX-2与HCC的发生、发展有密切关系,但COX-2在HCC耐药性中的作用机制尚不明确,本研究对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象

肝细胞癌患者52例,均来自本院2003年10月～2005年6月期间肝胆外科住院病人,男39例,女13例,年龄 28～76岁,平均 51.4岁;其中36例患者术前检查HBsAg阳性,30例患者存在不同程度的肝硬化,32例患者AFP≥400 μ g/L,术前Child肝功能分级A级24人,B级28人,按国际抗癌协会的TNM分期标准Ⅰ期23例,Ⅱ期15例,Ⅲ期14例。肿瘤直径在1.5～11.0 cm,平均3.8 cm;患者术前均未行放、化疗,所有患者均在全麻下行肝癌切除术,并取部分正常肝组织,术后病理切片检查均为原发性肝细胞癌,50例为结节型肝癌,2例为巨块型肝癌。

1.2 试剂与引物

鼠抗人P-糖蛋白单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司,鼠抗人COX-2单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司,DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。COX-2基 因 上 游 引 物:5′-AAAGAAT TCATGCTCGCCCGCGCCCTCT-3′,下游引物序列 :5′-AAATCTAGATTATGACTGTCTTGAAAA A-3′,扩增片段328 bp:mdr1基因上游引物:5′-AAAGAATTCGCTCATTCGAGTAGCGGCTC-3′, 下游引物:5′-AAAGTCGACTTACC T TTTATTGTTCAGT T-3′,扩增片段 401 bp;β-actin上游引物:5′-AAATGGCAC CACACCT TCTACAA-3′, 下 游 引 物:5′-AAAGCAGCTCGTAGCTCTTCTC C-3′,扩增片段372 bp。

1.3 RT-PCR检测COX-2 mRNA和mdr1 mRNA的表达

从60例原发性肝癌中随机抽取52例,无菌条件下切取原发性肝癌及癌周2 cm处肝组织新鲜标本,按 TRIZOL试剂盒说明提取组织总RNA,采用RT-PCR检测其COX-2 mRNA和mdr1 mRNA的表达。RT-PCR条件:50℃预变性30 min,94℃变性2 min,55℃退火30 s,72℃延伸 1 min,扩增30个循环,最后72℃补平7 min。取10 μ L扩增产物在1%琼脂糖凝胶在紫外分析仪下观察结果,用Bio-Rad Doc Gel 2000凝胶成像分析系统进行拍照。结果以相对光密度值(relative optical density,ROD)×面积(A)表示。mRNA相对含量=(目的基因条带ROD×A)/(βactin条带 ROD×A)。

1.4 免疫组织化学SP法检测COX-2蛋白和P-gp蛋白表达

全部病理标本经4%甲醛固定,梯度酒精脱水、二甲苯透明后石蜡包埋,普通切片机连续切片(4 μ m),以3%H2O2阻断内源性过氧化物酶。用10%BSA封闭以减少非特异性着色。再加入相应一抗(抗COX-2或P-gp抗体),4℃孵育过夜,PBS洗涤3次后加入1∶200生物素标记的二抗工作液,37℃孵育30 min;滴加浓度为1∶200的辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃孵育30 min;显微镜下监测DAB显色,苏木精复染,常规脱水、透明、封片。实验以封闭液代替一抗作阴性对照。两者染色均为棕黄色,在200倍光镜下至少观察5个视野,计数100个细胞中肿瘤染色细胞,(-)阴性:细胞阳性数<10%。(+)阳性:>10%的细胞数呈阳性反应。( )强阳性:>50%的细胞数呈阳性反应。

2 结 果

2.1 COX-2 mRNA和mdr 1 mRNA在肝癌组织中的表达

RT-PCR结果显示COX-2 mRNA在正常肝组织中无表达,52例HCC组织中有44例HCC组织和癌旁组织中均有表达,其相对表达量分别为0.724±0.050和0.420±0.068,两者比较有显著性差别(P<0.01),其中,11例高分化和32例中、低分化的HCC组织中COX-2mRNA的相对表达量分别为0.698±0.044和0.762±0.041(P<0.05),在不同临床分期、肿瘤大小、AFP水平、有无转移的HCC组织之间COX-2 mRNA相对表达量无显著性差别(P>0.05)。RT-PCR显示mdr 1 mRNA在HCC组织、癌旁组织和正常肝组织中均有表达,在HCC组织和癌旁组织中相对表达量分别为0.675±0.036和0.548±0.033(图 1)。

图1 RT-PCR检测COX-2 mRNA、mdr1mRNA的表达

2.2 COX-2和P-gp在肝癌组织中的表达

COX-2的表达主要定位于胞质,阳性物质呈棕黄色颗粒状(图2),COX-2蛋白在HCC组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为82.7%和23.1%,COX-2在癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织(P<0.01)。P-gp表达主要位于肝癌细胞膜上,少量位于胞质内,在HCC组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为86.6%和30.7%,P-gp在癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织(P<0.01)。

图2 COX-2和P-gp在HCC组织中的表达

2.3 COX-2 mRNA与mdr 1 mRNA在HCC组织中表达的相关性分析

全部HCC组织中有42例同时表达出COX-2 mRNA和mdr 1 mRNA,两者的相对表达量分别为0.725±0.050和0.574±0.036,相关分析表明COX-2 mRNA与mdr 1 mRNA在HCC组织的表达呈显著的正相关关系(r=0.563,P<0.01,图3)。

图3 COX-2mRNA与mdr 1 mRNA在HCC组织相对表达量关系的散点图

2.4 COX-2的表达与HCC临床病理特征的关系

将52例HCC标本按分化程度、是否合并HBsAg及肝硬化、肿瘤大小、AFP水平、TNM 分期及是否转移等临床特征分类,统计COX-2的阳性表达与HCC组织临床特征的关系(表1)。由表1可见,在癌组织中,高分化的HCC组织COX-2的表达阳性率为61.1%(11/18),低分化及分化较差的HCC组织为94.1%(32/34),分化程度高的HCC组织中COX-2的阳性表达率明显低于低分化及分化较差HCC组织中COX-2的表达。HBsAg阳性HCC组织中COX-2表达率91.7%(33/36)明显高于HBsAg阴性HCC组织中COX-2的表达 62.5%(10/16,P<0.05)。

表1 C OX-2表达与HC C临床病理特征的关系

3 讨 论

环氧化酶(COX)是花生四烯酸或其他二十碳脂肪酸转化为前列腺素的关键限速酶,主要参与机体的炎症和肿瘤的发生、发展,其中COX-2通过抑制肿瘤细胞凋亡,抑制免疫应答,促进肿瘤新生血管的形成等机制,参与了肿瘤的发生、发展过程[1]。近年来研究表明,COX-2与肿瘤发生具有明显关系,许多肿瘤,如结肠癌,乳腺癌,前列腺癌,肺癌,肝癌等COX-2呈高表达状态,并在肿瘤的发生、发展及转移中起重要的作用[2]。在HCC组织中COX-2表达与分化程度有密切关系,总体而言在正常肝脏组织中COX-2不表达,高分化HCC组织中COX-2的表达明显强于中、低分化的HCC组织,早期HCC通常分化较好,提示COX-2在HCC发生的早期阶段起着重要作用[3]。在高分化的HCC,COX-2表达高于低分化的HCC和正常肝组织,表明COX-2可能在HCC发生早期具有重要作用,在HCC病人COX-2表达增加其预后较差,在慢性肝炎组织尤其是肝硬化组织中COX-2的表达也是显著升高的,因此,COX-2在肝硬化进展为HCC的过程中起重要的促进作用,可能是COX-2过度表达改变了细胞凋亡和增殖相关基因的表达,促进了细胞发生恶性变化[4]。但是,我们检测表明中、低分化HCC组织中 COX-2阳性表达高于分化较好的HCC组织,COX-2阳性表达在HBsAg阳性HCC组织高于HBsAg阴性的HCC组织,推测COX-2在乙肝患者中HBV引起肝细胞的变性过程中起着重要作用。此外,我们发现COX-2的表达水平与AFP表达高低、是否转移、肿瘤大小以及临床病理分期无显著相关,提示COX-2的表达与HCC的预后关系不大。

多药耐药现象(MDR)是导致HCC化疗失败的主要因素,MDR是指肿瘤对某种抗肿瘤药产生耐药性的同时对结构和作用机制不同的其他抗肿瘤药产生交叉耐药的现象。肝癌的MDR形成的机制较为复杂,与多种耐药基因及其蛋白表达有密切关系,但是mdr1基因和P-gp是导致肝癌具有MDR的主要机制。P-gp是细胞膜蛋白,ATP结合盒转运蛋白超家族成员,通过消耗能量从肿瘤细胞中泵出抗癌药物。已有证据表明,在HCC多药耐药性与COX-2过度表达有关,COX-2过度表达可以上调 mdr1基因和P-gp的表达[5]。有研究表明肝癌细胞MDR的形成同时伴有COX-2和诱导型一氧化氮合酶的表达。P-gp和COX-2常常同时在HCC表达增强,与MDR有关并且预后较差,COX-2可以诱导P-gp表达,使用COX-2特异性抑制剂塞来昔布(Celecoxib)作用于表达P-gp的HCC耐药株,发现10 mmol/L的塞来昔布可以减低P-gp、Bcl-xL和Bcl-2表达,在MDR肝癌细胞诱导Bax从胞浆易位到线粒体,导致细胞色素c释放至胞浆,原因在于caspase-3活化导致凋亡增加,50 mmol/L的塞来昔布轻微增加COX-2和P-gp的表达,没有改变Bcl-xL和Bcl-2的表达[6]。本研究表明COX-2和P-gp在肝细胞癌中表达具有明显的相关性,证实了COX-2参与了HCC的多药耐药机制。COX-2可以作为逆转HCC耐药性的一个靶点,选择性抑制COX-2活性可能作用于P-gp,增加抗癌药物浓度,降低对抗癌药物的耐药性,增强常规化疗疗效。

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[2] Cusimano A,Foderà D,D′Alessandro N,et al.Potentiation of the antitumor effects of both selective cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 inhibitors in human hepatic cancer cells by inhibition of the MEK/ERK pathway[J].Cancer Biol Ther,2007,6(9):1461.

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