中药复方对解脲支原体感染小鼠T细胞亚群和细胞因子的影响*

刘 弘赵 红苑贺英潘 琳孙红妹

1中日友好医院（北京100029）

2首都儿科研究所细菌研究室（北京100600）

四逆散和桂枝茯苓丸系汉代张景岳的经方，临床运用广泛。我科名老中医许润三教授以此创制了妇科Ⅰ号方和Ⅱ号方，治疗盆腔炎性疾病取得了良好的临床疗效。盆腔炎症性疾病及其后遗症（如不孕、疼痛、异位妊娠等）严重影响了广大妇女的生活质量，其病原体主要为淋病奈瑟球菌、衣原体、支原体等［1］。本研究选取临床行之有效的两个中药复方，利用解脲支原体阴道接种小鼠生殖器官感染模型探讨中药对盆腔炎症性疾病的免疫调节的影响。

1 材料与方法

1．1 菌株 解脲支原体血清8型菌株，由首都儿研所提供。

1．2 动物 BALB/c雌性8～10周龄小鼠 48只，体质量18～20g。购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2006-2009。饲养于北京中医药大学实验动物中心国家标准实验室。

1．3 药物 妇科Ⅰ号方：由柴胡 10g，枳实 15g，赤芍 20g，生甘草 10g，丹参 30g，蒲公英 30g等组成，水煎剂浓缩为 0．8mg/mL备用；妇科Ⅱ号方：由桂枝 10g，茯苓 10g，桃仁 10g，赤芍 10g，牡丹皮10g等组成；阿齐霉素胶囊，250mg/粒，齐鲁制药有限公司生产，国药准字H10970061，溶于注射用水配成1．9mg/mL备用；苯甲酸雌二醇注射液，2mg/mL，上海通用药业股份有限公司生产，国药准字H31021114，产品批号090801。

1．4 仪器与试剂 台式冷冻离心机，湘仪TGL-16；流式细胞仪（BD公司FACSCalibur）；超净台，泰斯特；全自动多功能酶标仪：MULTISKANMK3，Thermo，USA； 电热恒温培养箱：DH4000A，天津泰斯特；MINIshaker：MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER。常规化学试剂购于北京化学试剂公司，红细胞裂解液、Leucoperm reagent、anti-mouse CD3e（EM0306）、anti-mouseCD4（BM0401）、anti-mouseCD8a（EM0804）由尚柏生物医学技术有限公司提供。 鼠 IFN-γ、TNF-ɑ、IL-4 购自 RB，批号：2R582、2R602、2R482。

1．5 解脲支原体血清8型感染液制备 取无菌PPLO培养基100mL，按5∶1比例加入小牛血清20mL混匀，分装到无菌锥形瓶中。取-70℃保存的菌种，于37℃水浴中解冻后，吸取100μL菌液加入培养基中。盖硬胶塞后用封口膜封口，于37℃恒温箱中静置培养，配成1．0×103CCU/mL浓度备用。

1．6 造模方法 小鼠造模前取阴道分泌物支原体培养均为阴性。小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0．2mL，每周1次，共4次。在皮下注射雌激素第2次后阴道接种支原体解8感染液，采用移液枪和一次性枪头，暴露小鼠阴道，注入感染液20μL，待液体被阴道黏膜完全吸收后，放回笼内，每只鼠分笼喂养。每日接种1次，连续3次。1周后再加强接种1次。雌激素最后1次皮下接种后1周，取小鼠阴道分泌物进行支原体液体培养，全部为阳性，视为造模成功。为了明确造模过程中雌激素对于小鼠免疫状态有无影响，单独设立了雌激素对照组，皮下注射雌激素方法同前，阴道接种等量生理盐水。

1．7 分组与给药 小鼠共随机分为阿齐霉素组、妇科Ⅰ号方组、妇科Ⅱ号方组（各组每日0．4mL药物灌胃）、模型组、正常对照组、皮下注射雌激素组（各组给予等剂量生理盐水灌胃），14d后处死动物。

1．8 检测指标 T细胞亚群：小鼠眼球取血，取全血样本50μL加入 CD3、CD4、CD8 各 5μL，充分混匀，室温避光染色 30min；然后加入红细胞裂解液2mL，混匀后室温避光溶解红细胞8min；加入5%PBS 2mL洗两次，1000r/min离心5min，弃上清后加入0．5mL 0．5%的多聚甲醛重选沉淀固定，4℃过夜后，样品上流式细胞仪检测。细胞因子：小鼠处死后迅速分离脾脏，制备脾组织匀浆，4000r/min离心15min，吸取上清液；采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测 IFN-γ、TNF-ɑ 和 IL-4 浓度。

1．9 统计学处理 应用SPSS 16．0统计软件。采用t检验和单因素方差分析，数据以（±s）表示。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 各组T细胞亚群比较 见表1。模型组和雌激素组CD4+/CD8+与正常对照组相比显著降低，中药及西药干预后能够提高这一比值，但与模型组相比，差异无统计学意义。雌激素组的CD4+和CD8+与模型组相比均明显增高，差异有统计学意义（P ＜0．05），但 CD4+/CD8+与模型组相比有降低，差异无统计学意义，与正常对照组相比降低，差异有统计学意义（P＜0．05）。

表1 中药复方对于T细胞亚群的影响 （%，±s）

表1 中药复方对于T细胞亚群的影响 （%，±s）

与模型组比较，*P＜0．05；与正常对照组比较，△P＜0．05。

CD4+/CD8+阿齐霉素组 4．02±0．38妇科Ⅰ号方组 4．11±0．70 CD8+11．29±4．45 9．38±4．83 11．61±5．98模型组 7 3．66±0．43组 别n 7 8妇科Ⅱ号方组7 CD4+44．73±15．41 37．89±18．12 43．97±19．404．02±0．76 39．05±10．96 10．84±3．70正常对照组 9 51．69±15．64 12．22±4．30 4．32±0．45*皮下注射雌激素组 6 59．12±10．20* 16．39±2．49* 3．61±0．35△

2．2 各组细胞因子比较 模型组和雌激素组的IFN-γ、IL-4、TNF-ɑ与正常对照组相比，均有升高的趋势，药物干预后均有降低，但差异无统计学意义。

3 讨 论

盆腔炎症性疾病及其后遗症的动物模型近年来发展为机械损伤加细菌感染［2］，致病菌主要为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和链球菌等需氧菌；还有就是动物阴道接种支原体［3］或衣原体［4］。这些动物模型无论从感染因素、感染途径和病理特点都与人类盆腔炎症性疾病及其后遗症越来越相似。本文采取的造模方法小鼠生殖器官炎症病变是明显的，既往文献也有类似报道［5］。

表2 中药复方对细胞因子的影响 （pg/mL，±s）

表2 中药复方对细胞因子的影响 （pg/mL，±s）

IL-4 51．80±37．21 56．64±31．86 49．07±20．26模型组 7 4．70±13．57 TNF-α阿齐霉素组 3．93±23．28妇科Ⅰ号方组 4．51±18．08组 别n 7 8妇科Ⅱ号方组7 IFN-γ 251．26±168．18 263．61±157．23 231．75±96．094．26±12．51 235．48±102．33 60．86±37．00正常对照组 9 205．85±118．10 45．97±22．92 3．52±15．70皮下注射雌激素组 6 310．87±210．82 57．28±36．10 4．97±24．31

妇科Ⅰ号方理气活血、清热止痛，适用于盆腔炎症性疾病及其后遗症气滞血瘀证；妇科Ⅱ号方温通活血、化瘀止痛，适用于盆腔炎症性疾病寒凝血瘀证。这两个经验方临床表明能够有效缓解患者的症状和体征，以往的苯酚糊致炎动物实验［6］也证实对于炎症病理有明显改善。但是中医药取效的作用靶点是多方面的，同时我们在临床中发现盆腔炎症性疾病患者支原体阳性率较高，因此设计本研究来探讨中药对于支原体引起的小鼠生殖器官感染的免疫功能是否有影响。

目前中药对于免疫功能影响的实验研究有从方药角度进行，也有从疾病角度进行。如有报道在加味四逆散治疗大鼠肝郁证溃疡性结肠炎研究中，该方能够显著降低IL-1β、IL-6，上调了IL-4和IL-10，从而有利于炎症的消除和组织的修复［7］。桂枝茯苓丸治疗人宫颈癌荷瘤小鼠，能够显著升高小鼠脾脏IL-2水平。亦有报道［8-9］中药能够显著降低支原体阴道感染小鼠血清IFN-γ和 TNF-α。

T淋巴细胞亚群在人体细胞免疫反应中有着重要的作用。一般认为CD4+/CD8+比值可反映机体细胞免疫功能状态，如CD4+/CD8+比值下降即提示患者机体处于免疫抑制状态。本研究发现雌激素预处理以及支原体感染均能导致小鼠免疫功能下降，从而引发生殖器官炎症的发展，中西药物组均能提高这一比值，但差异未见统计学意义，考虑可能与样本量小有关系。

CD4+Th细胞由Th0向Th1、Th2或Th3细胞分化。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-ɑ等，促进细胞介导的免疫应答，促进疾病的发展；Th2 细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 等，促进B细胞增殖，增强抗体介导的体液免疫，促进疾病的恢复。本研究发现雌激素预处理以及支原体感染均能导致小鼠炎症性细胞因子增多，中西药物治疗均能降低脾组织IFN-γ、TNF-α和IL-4，但差异无统计学意义，考虑是否脾组织的细胞因子浓度与外周血的浓度有差异，需要进一步实验证实。

支原体感染可以引起小鼠生殖器官炎症，中药对于病原体的清除可能不及敏感抗生素，但其多成分、多靶点作用于炎症病理的缓解，也可能参与机体免疫网络调控的整体平衡有关，而不单是一个或几个细胞因子的高表达或低表达。今后可以考虑病证结合动物模型，进一步从免疫网络调节方面探索中医药的作用机制。

［1］ 刘朝晖，廖秦平．盆腔炎性疾病致病微生物及治疗方案研究［J］．实用妇产科杂志，2010，26（7）：522-524．

［2］ 黄丽，孙培文，罗隽，等．慢性盆腔炎模型的建立与评价［J］．中南药学，2010，8（6）：469-472．

［3］ Furr PM，Taylor-Robinson D.The establishment and persistence of Ureaplasma urealyticum in oestradiol-treated femalemice［J］.JMed Microbiol，1989，29（6）：111-114.

［4］ M Tuffrey，F Alexander，C Inman，etal.Correlation of infertility with altered tubalmorphology and function inmicewith salpingitis induced by a human genital-tract isolate of Chlamydia trachomatis［J］.Reprod Fert，1990，156（88）：295-305.

［5］ D Taylor-robinson，PM Furr.Observationson experimental colonisation ofmice by ureaplasmas of hum an origin［J］.Med Microbiol，2002，51（4）：866-870.

［6］ 王清，张宗芳，刘弘.中药三种途径给药治疗输卵管阻塞模型的结果分析［J］.中药研究与信息，2004，6（11）：35-37.

［7］ 谷松，郭晓东，关庆增，等.加味四逆散对溃疡性结肠炎肝郁大鼠模型细胞因子网络的调节作用［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12（3）：56-58.

［8］ 韩延华，辛雪艳.消抗灵Ⅱ号对小鼠解脲支原体感染及感染后血清中干扰素-γ 的影响［J］.世界中西医结合杂志，2008，3（2）：83-85.

［9］ 韩延华，于晨芳，韩延博.消抗灵Ⅱ号对小鼠解脲支原体感染及感染后血清中 TNF-ɑ 的影响［J］.世界中西医结合杂志，2008，3（3）：134-136.