1株多重耐药性鸽源大肠杆菌的分离与鉴定

2011-02-03张彬彬邵慧君王彦红刘文博扬州大学兽医学院江苏扬州225009

养禽与禽病防治 2011年5期

张彬彬邵慧君王彦红刘文博（扬州大学兽医学院江苏扬州） 225009

1株多重耐药性鸽源大肠杆菌的分离与鉴定

张彬彬邵慧君王彦红刘文博（扬州大学兽医学院江苏扬州） 225009

大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)感染包括急性败血症、肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、脐炎、脑炎、气囊病以及其他部分或全部由大肠杆菌引起的疾病[1，2]。经研究表明本病在世界各地均有发生，50%以上的菌株有多重耐药性，该病是比较常见的人畜共患病，但是往往被人们所忽视[3]。鸽的大肠杆菌病也是鸽子养殖过程中常见的细菌病，并且鸽是大肠杆菌的一个天然储存宿主[1]。本病一年四季均可发生，尤以冬季和夏季最为常见，病鸽是造成该病最主要的传染源。大肠杆菌易产生耐药性[2]，在选药治疗时存在一定的盲目性。笔者在临床上分离了1株鸽大肠杆菌，并测定了其对16种抗菌药的敏感性。

1 材料与方法

1.1 病料来源

无锡某养殖场共饲养了1000羽1年龄期的美国王鸽，正常免疫接种鸽瘟疫苗与禽流感疫苗，2010年7月鸽突然死亡，每天5～10只，部分鸽采食量下降，庆大霉素及丁胺卡那霉素（阿米卡星）饮水不见好转，持续10天，遂送5只病死鸽来我院诊断。病理解剖后发现死亡的鸽肾脏充血，部分有苍白色坏死点；肝脏肿大充血，部分呈土黄色；胰脏出现充血，肠道有积液，且鼻腔也出现黏液。

1.2 试验材料

培养基：LB培养基；麦康凯琼脂培养基，按通用的组方自行配制。其中麦康凯琼脂粉为上海中科昆虫生物技术开发有限公司产品，琼脂粉与氯化钠为国药集团化学试剂有限公司产品，蛋白胨与胰酶为OXOID公司产品。

染色液：革兰氏染色液。

生化发酵管：生化反应管为上海市医学化验所试剂厂产品，计14种。

药敏试纸片：杭州天和微生物公司生产，计16种。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离培养

无菌操作从病死的鸽肝脏取样，接种于LB平板，置于37℃温箱中培养24h后观察菌落特征，待典型菌落出现后，再挑取典型菌落接种到麦康凯培养基上同样置温箱培养24h备用。

1.3.2 细菌的鉴定

形态学鉴定：从纯培养的麦康凯琼脂平皿上挑取菌落制成涂片，作革兰氏染色，然后在高倍油镜

张彬彬邵慧君王彦红刘文博下观察。

生化鉴定：按常规方法进行。将所获得分离菌的纯培养菌落1～2个，分别接种于各种微量生化发酵管内，置37℃温箱培养24～48h，定时检查反应结果。

1.3.3 药物敏感性试验

用接种环挑取单个菌落涂布于麦康凯琼脂培养基，再放药敏纸片，置37℃温箱培养18h。观察测量抑菌圈的大小并记录结果。此次选用16种抗菌药物：链霉素（30μg）、复方新诺明（23.7/1.25μg）、庆大霉素（10μg）、氯霉素（30μg）、呋喃妥因（300μg）、美洛西林（75μg）、萘啶酸（30μg）、氟罗沙星（5μg）、羧苄青霉素（100μg）、卡那霉素（30μg）、四环素（30μg）、左氟沙星（5μg）、恩诺沙星（5μg）、阿米卡星（30μg）、头孢西丁（30μg）和头孢噻肟（30μg）。药物敏感性的判定标准采用中华人民共和国卫生行业标准的纸片法抗菌药物敏感试验标准。

1.3.4 病毒分离

取病死鸽的脑、气管、肺和肝研磨，加入含双抗（青霉素、链霉素每毫升各 1000IU）PBS制成1∶5的组织液，冻融3次,5000r/min，离心10min,取上清液接种 9～11日龄 SPF鸡胚，每枚 0.2mL，置37℃温箱培养，观察结果，收集尿囊液检测其血凝性并盲传3代。

2 结果

2.1 细菌分离

原代细菌在LB培养基上为湿润，直径2～4mm的乳白色菌落，第二代在麦康凯培养基上培养24h后出现2～4mm大小的亮粉红色菌落，周围有沉淀线环绕。革兰氏染色呈典型的革兰氏阴性中等大小的杆菌。

2.2 生化特性

取纯培养的细菌进行生化试验，由其结果与上述细菌培养特性结合分析得出，所得的细菌为大肠杆菌，生化反应结果：葡萄糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇为阳性；卫矛醇、蛋白胨、尿素、水杨苷、硫化氢、木糖和肌醇为阴性。

2.3 药敏试验

大肠杆菌的耐药性由培养基上所选择抗菌药物的抑菌圈大小与敏感标准来判定，其结果表明，所分离的鸽大肠杆菌除了对头孢噻肟高度敏感外，对链霉素、复方新诺明和庆大霉素等15种药物均不敏感，见表1。

2.4 病毒分离

组织液接种SPF鸡胚后培养至120h，鸡胚仍无死亡和病变，其尿囊液无血凝性，盲传3代仍无血凝性，认为未分离到病毒，弃之。

3 小结与讨论

3.1 送检病死鸽组织中未分离到病毒。由病原菌的形态学特征、培养特性及生化试验确定引起鸽死亡的原因是大肠杆菌感染导致的急性败血症，用庆大霉素和阿米卡星治疗不佳的原因可从药敏结果得到解释。较多研究结果表明：大肠杆菌对多种药物敏感[2～4]：如环丙沙星、恩诺沙星、先锋5号及氯霉素高度敏感，而由本次药敏试验显示该养殖户在养殖上滥用抗生素的情况已十分严重，已经产生了对卡那霉素、庆大霉素、氯霉素和链霉素均耐药的菌株，在所选的16种抗菌药物中除了头孢噻肟，其余药物对该菌株均产生不同程度的耐药，应引起养殖户的高度重视。因此建议在确诊的基础上，通过药敏试验，有目的、有针对性地用药，避免滥用药物，

且用药应有足够疗程和剂量，或在使用抗菌药物的过程中注意交叉用药或联合用药，以避免菌株耐药性的增强，尽量减少耐药菌株产生。