DNS法测定玉米须保健饮料中总多糖含量

蔡丽朋,惠秋沙

(山东中医药大学,山东济南 250355)

玉米须 (stigm a m aydis)是禾本科玉蜀黍属植物玉米 ( Zea m aysL.)的干燥花柱和柱头,其味甘、淡、性平。玉米须含有多种对人体有益的化学成分,如多糖、甾醇、黄酮、氨基酸、无机元素、有机酸等[1],现代药理研究证明其中的多糖更是有调节免疫、抗肿瘤、保肝利胆、降血糖、消水肿的作用[2]。将玉米须制成保健饮料不但充分利用了资源,而且具有广泛的市场。由于玉米须所含多糖的特殊药理作用,玉米须保健饮料中所含的植物多糖成为实际生产中质量控制的重要指标。本实验采用二硝基水杨酸 (DNS)法测定产品中总多糖的含量,报告如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 U-2800紫外 -可见分光光度计 (日立公司); FA1004型电子分析天平 (上海精密科学仪器有限公司);电热恒温水浴锅 (上海医疗器械五厂);DZF-3型真空干燥箱(上海福玛实验设备有限公司);DZ4-0.8型低速自动平衡微型离心机(北京医用离心机厂)。

1.2 试药 葡萄糖 (105℃干燥至恒重);无水乙醇;乙醚;丙酮;氢氧化钠;DNS(3,5-二硝基水杨酸);酒石酸钾;无水亚硫酸钠;蒸馏水,实验所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称取在 105℃干燥至恒重的葡萄糖 0.100 3 g,置于 100 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容,摇匀,即得 1.003 mg·mL-1葡萄糖对照溶液。

2.1.2 DNS试剂的配制 精密称取DNS 3.15 g溶于少量水中,加入 2 mol·L-1氢氧化钠溶液 131 mL,接着边搅拌边依次加入 91 g酒石酸钾、2.5 g苯酚及 2.5 g无水亚硫酸钠,然后转移至 500 mL容量瓶中,定容,摇匀。后转移至棕色瓶中,放置一个星期后使用。

2.2 实验条件的确定

2.2.1 测定波长的确定 在“2.2.2.2”正交实验反应结束测定吸光度之前,扫波长。得DNS法有多个最大吸收波长,尤其在小于 480 nm时有很多最大吸收波长,但杂乱无序,但大于520 nm时,吸收较稳定,故其取 520 nm为测定波长(图 1)。

图1 波长扫描图

2.2.2 供试品溶液最佳制备条件确定

2.2.2.1 供试品溶液的制备方法[3]量取样品玉米须保健饮料 12 mL,置离心管中以 3 000 r·min-1的转速离心 10 min,精密量取上清液 10 mL,加入无水乙醇适量,静置过夜。将上述液体离心,并依次用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤沉淀。沉淀减压真空干燥,配成溶液移入 50 mL量瓶中,加入 6 mol·L-1盐酸适量,沸水水浴一定时间后迅速冷却,加 4 mol ·L-1氢氧化钠溶液适量调 pH=9,定容到 50 mL。

2.2.2.2 正交试验考察供试品溶液制备的条件 据文献报导[4],供试品溶液的制备方法,影响多糖水解成还原糖反应程度的因素主要有 6 mol·L-1盐酸用量、醇沉浓度及样品水解时间。下面以这三个因素作为考察因素,以吸光度作为考察指标,各取 3个水平,选用 L9(34)正交表进行实验,以确定最佳条件。因素水平见表 1,试验安排及结果见表 2,结果分析见表3。

根据表 2制备不同因素不同水平的供试品溶液,精密量取供试品溶液 4 mL共 9份,分至 25 mL容量瓶中,另取水 2 mL置于 25 mL容量瓶中作空白对照,各容量瓶均加入 DNS试剂 1.5 mL,沸水浴 5 min[4,5]。反应结束后,流水冷却,加水至容量瓶刻度,以空白为参比,于 520 nm处测定吸光度。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析

从表 2的正交试验结果及表 3的方差分析数据,综合考虑,A3B3C1为最优反应条件,即 6 mol·L-1盐酸 7 mL,85%醇沉,水解时间 10 min为测定多糖的最优条件。

2.2.2.3 根据正交结果制备供试品溶液 由正交试验得: 85%醇沉,6 mol·L-1盐酸 7 mL,水解时间 10 min为最佳条件。故配制样品溶液时按照此条件,其余操作同“2.2.2.1”项。

2.3 标准曲线的绘制 精密量取葡萄糖对照品溶液 0.2、0.4,0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL分别置 25 mL容量瓶中且分别补水至 2.0 mL。另取水2.0 mL置于25 mL容量瓶中作空白对照。上述溶液分别精密加入 DNS试液 1.5 mL,于沸水浴中煮沸 5 min,取出立即冷却,用水稀释至刻度,摇匀。以空白为参比,于 520 nm波长处测定吸光度。

以吸光度(A)对葡萄糖质量浓度(C)进行线性回归,得回归方程:A=0.014 1C-0.074 7,r=0.999 4。表明葡萄糖溶液在 8～56μg·mL-1浓度范围与吸光度呈良好的线性关系,结果见表 4,图 2。

表4 标准曲线结果

图2 标准曲线

2.4 精密度及重复性试验 精密量取对照品溶液 0.8 mL分置 5支容量瓶中,加水 1.2 mL,按“2.2.2.2”项下“另取水2.0 mL置于 25 mL容量瓶中”起,依法操作,测得吸光度 A分别为 0.381、0.377、0.378、0.383、0.376,算得 RSD = 0.77%,说明方法精密度良好。取同一批的样品玉米须保健饮料制备供试品溶液 5份,依法测定吸光度,结果分别为0.306,0.302,0.311,0.308,0.305,求得 RSD =1.1%,说明重复性良好。

2.5 稳定性试验 取显色后的供试品溶液,2 h内分别于 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h测吸光度,结果分别是 0.309,0.307, 0.309,0.308,0.304,求得 RSD=0.675%,说明实验方法稳定性良好。

2.6 加样回收率试验 取同一批玉米须饮料,按供试品溶液制备方法处理的水解液 5份,再分别加入相同量的葡萄糖,各精密量取2 mL,分别加入25 mL容量瓶中,按样品含量测定的方法测其含量,进行回收率实验[6],结果见表 5。

表5 回收率实验结果

2.7 样品含量测定 精密量取 4 mL供试品溶液 5份,分别加入 5个 25 mL容量瓶中,其余操作照“2.2.2.2”项下自“另取水 2 mL置于 25 mL容量瓶中”起,测定吸光度代入标准曲线公式算出对应的浓度C,含量结果以下公式计算(见表 6):

C样:样品保健饮料总多糖含量 (mg·mL-1)

C:吸光度代入标准曲线求出相应浓度(μg·mL-1)

V1:样品保健饮料体积 10 mL

V2:供试品溶液体积 50 mL

V3:测定所取供试品溶液体积 4 mL

V4:显色后供试品溶液体积 25 mL

表6 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 DNS比色法的原理是 3,5-二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖共热后生成棕红色的氨基化合物(3-氨基 -5-硝基水杨酸)[4],在紫外最大吸收波长处其吸收值与糖浓度呈线性关系。

3.2 多糖含量测定常用的方法还有苯酚硫酸法[7]和蒽酮硫酸法[8],但这两种方法都要用到强腐蚀性的浓硫酸,不便操作,再者浓硫酸遇水剧烈放热使显色条件难以控制,影响测定结果;蒽酮硫酸试剂不稳定,苯酚溶液易氧化,都得临用新配。且在测定A值过程中,蒽酮硫酸与苯酚硫酸法的反应容量瓶始终置于冰水浴中。DNS法不需要用到浓硫酸,而且DNS法试剂稳定,置于常温下不需冰水,能克服上述两种方法的缺点。

3.3 此次实验测定的是玉米须保健饮料中总多糖的含量,并都用了丙酮及乙醚多次洗涤除去脂类以防其对结果造成影响。另据文献报导[3],DNS法可以通过配置不同的供试品溶液而排除单糖的影响,可以看做是 DNS法另一个较大的优势。

[1] 叶盛英,高文远.中药玉米须研究进展 [J].中成药, 2008,30(5):745-746.

[2] 周鸿立,张艳,金海甲,等.玉米须多糖药理作用及提取纯化研究进展 [J].吉林化工学院学报,2009,26(1): 23-26.

[3] 崔本连,宋海韬,齐放,等.3,5-二硝基水杨酸法测定安络小皮伞菌中多糖的含量[J].长春中医药大学学报,2007,23(4):25-26.

[4] 孙伟伟,曹维强,王静.DNS法测定玉米秸秆中总糖[J].食品研究与开发,2006,23(4):25-26.

[5] 王丽娜,王淑敏,郭云峰,等.DNS法测肾康胶囊中多糖的含量[J].吉林中医药,2005,25(11):60-61.

[6] 张华.补气生血口服液中不同药物组合方式提取液中的多糖含量测定[J].山东中医杂志,2004,23(9):556 -557.

[7] 涂宗财,李敏,刘光宪,等.苯酚 -硫酸法测定油菜花粉多糖含量的研究[J].食品工业科技,2007,28(4):219 -221.

[8] 骆苏芳,彭树灵,刘国章,等.蒽酮硫酸法测定益元口服液中总多糖的含量 [J].广东药学院学报,2007,23 (1):3-4.